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Encyclopedia of Experiments

Malpighian Tubule Dissektion von einer Erwachsenenfliege: Isolieren einer Osmoregulierungs- und Ausscheidungsorgan

Overview

Dieser Artikel beschreibt die Zerlegung der vorderen Malpighian Tubuli (MT) von einer weiblichen Drosophila-Fliege und ein Beispielprotokoll von Rossano et al. (2017), in dem die MTs für die Live-Bildgebung in einer Perfusionskammer vorbereitet sind.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Rossano und Romero, Optische Quantifizierung des intrazellulären pH-Werts in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia mit einem fluoreszierenden genetisch kodierten pH-Indikator, J. Vis. Exp. (2017).

1. Herstellung von Poly-L-Lysin-Dias

  1. Zeichnen Sie einen 40 x 20 mm Rand mit einem hydrophoben PAP-Stift um die Spitze der Standard-Dias von 75 x 25 mm und legen Sie ihn bei RT 15 min zum Trocknen beiseite. Verwenden Sie große Abdeckungen, wenn die Dias nicht mit Bildoptiken kompatibel sind.
  2. 2 ml Lager 0,01% Poly-L-Lysin (PLL) Lösung auf jede Rutsche übertragen und für 1 h bei RT beiseite stellen.
  3. Überschüssige PLL mit einer Pipette entfernen. Speichern Sie die Lösung in einer 50 ml konischen Durchstechflasche für die zukünftige Verwendung. Bei 4 °C lagern.
  4. Aspirieren Sie jede verbleibende Lösung mit einer Vakuumleitung. Führen Sie die Vakuumleitung über die gesamte Folienoberfläche aus, um sicherzustellen, dass keine Lösung auf den Folien verbleibt.
  5. Stellen Sie die Dias vor der Verwendung für 1 zusätzliche s bei RT beiseite. Bewahren Sie die Dias bei RT bis zu 1 Monat trocken in einem Standard-Diabuch auf.

2. Zubereitung von Trennschale und Glasstäben

  1. 0,5 ml Elastomerhärtungsmittel in einer 35 x 10 mm Polystyrol-Petrischale bei RT auf 4,5 ml Elastomerbasis geben, um eine Tiefe von 5 mm zu erzeugen. Mit einer Einweg-Pipette-Spitze mischen. Lassen Sie Elastomer O/N bei RT heilen.
    HINWEIS: Elastomer sollte klar und frei von Blasen sein. Das Löschen von Blasen kann erleichtert werden, indem Elastomerplatten 10 - 15 min nach dem Gießen in einem Vakuumglas aufbewahrt werden.
  2. Halten Sie eine Glasstange mit einem Durchmesser von 5 mm zwischen den Händen und schmelzen Sie die Mitte der Stange über einen beleuchteten Bunsenbrenner, während Sie die Enden auseinander ziehen. Da das Glas schmilzt, ziehen Sie schneller, um eine dünne (0,1 mm) und verjüngte Welle zu erzeugen (Abbildung 1).
    HINWEIS: Ein 45 ° Winkel am Schaft ist oft hilfreich im Umgang mit Tubuli. Dies kann erreicht werden, indem man eine Hand senkt, wenn der Schaft gezogen wird (siehe Abbildung 1).
  3. Brechen Sie die dünne Welle in der Mitte mit der stumpfen Seite einer einrandigen Rasierklinge aus Kohlenstoffstahl. Prüfen Sie das dünne Ende der Stange unter einem Sezierbereich, um sicherzustellen, dass der Bruch sauber ist.

3. Dissektion von Adult Drosophila Anterior Malpighian Tubules

  1. Sammeln Sie die Sezierschale und gezogene Glasstange aus Abschnitt 2, einen PLL-beschichteten Schlitten aus Abschnitt 1, einen Klebe-Bohrbrunnenteiler, Vakuumfett, einen 4 x 2" Absperrband, 2 Paar #5 feinen Zangen und 40 ml Aliquots eiskalter Schneider-Mediums und RT iPBS.
  2. Vakuumfett auf dem Dichtband verteilen und den Klebeperfusions-Well-Teiler auf das Band drücken, um den Boden mit Fett zu beschichten. Den Klebeperfusions-Well-Teiler abziehen und fettseitig auf einen PLL-beschichteten Schlitten legen. Entfernen Sie den Perfusionsbrunnenteiler, um einzelne Probenbrunnen in hydrophober Fettspuren zurückzulassen.
  3. Legen Sie 200 L RT iPBS in den fettumschlossenen Brunnen auf dem PLL-beschichteten Schlitten und bewegen Sie den Schlitten unter das Stereoskop.
  4. UAS-pHerry/capaR-GAL4-Fliegen in eine leere Fliegenfläschchen legen und 10 min auf Eis anieren.
    HINWEIS: Diese Anästhesiemethode sorgt im Gegensatz zuCO2dafür, dass die Fliegen nicht austrocknen.
  5. Gießen Sie das eiskalte Schneider-Medium in die Sezierende Schale und bringen Sie mit feinen Zangen eine einzelne anästhesierte Weiblichefliege unter einem sezierenden Stereoskop in die Schale.
  6. Halten Sie die Fliege am Thorax mit einer Reihe von Zangen und verwenden Sie die andere, um sanft das Hinterteil des Bauches zu greifen. Ziehen Sie das Hinterteil der Fliege mit den Zangen in kurzen, absichtlichen Bewegungen auf. Sobald das Hintergut sichtbar ist, greifen Sie das distale Ende und befreien Sie den Darm und die MTs von den darunter liegenden Tracheolen, indem Sie das Hintergut durch sich wiederholende, kurze Schlepper vom Körper wegziehen.
    HINWEIS: Die vorderen und hinteren MTs werden sichtbar sein, wo sie die Kreuzung des Mittelguts und des Hinterdarms durch den Harnleiter treffen. Das erste Paar MTs, die frei sind, werden wahrscheinlich die hinteren Tubuli sein, wenn sie das Hintergut umkreisen. Diese können ignoriert werden (Abbildung 2A).
  7. Drücken Sie die vorderen MTs am Harnleiter mit feiner Zange ab, sobald der zweite Satz von MTs frei vom Bauch ist. Dadurch werden die vorderen MTs vom Darm getrennt und der Harnleiter geschlossen.
  8. Nehmen Sie die freien vorderen MTs mit der gezogenen Glasstange auf, indem Sie die Stange unter den Harnleiter schieben, so dass die Tubuli auf beide Seiten fallen. Heben Sie die MTs direkt aus der Lösung heraus.
  9. Drehen Sie den Glasstab so, dass die MTs und der Harnleiter an der Unterseite der Stange haften und den Harnleiter direkt auf die Rutsche absenken. Befestigen Sie den Harnleiter und versiegeln Sie die distalen Enden der MTs, indem Sie den Harnleiter auf die Glasrutsche drücken (Abbildung 2B). Manipulieren Sie die MTs nicht mehr als nötig. Die MTs sollten in der Lösung mit dem Harnleiter an der Rutsche verankert werden.
  10. Verwenden Sie das feine Ende der Glasstange, um jeden Tubuli sanft über die Gleitfläche zu fegen. Halten Sie die Stange gegen die Rutsche, um zu vermeiden, dass die Tubule zerquetscht wird, und schieben Sie die Stange über die Oberseite des Tubules, indem Sie distal zu proximal bewegen, um die gesamte Länge jedes Tubules an der Oberfläche des PLL-beschichteten Schlittens zu befestigen (Abbildung 2C).
  11. Legen Sie den Klebeperfusions-Well-Teiler wieder auf die Rutsche, um einen kleinen flüssigkeitsgefüllten Brunnen über dem montierten Tubuli zu bilden.
  12. Stellen Sie die Probe auf die Mikroskopstufe. Positionieren Sie die Zu- und Abflusskapillaren über der Ein- bzw. Auslassöffnung des Perfusionsbrunnens.
    HINWEIS: Der Brunnenteiler kann weggelassen werden, wenn eine offene Perfusionskammer gewünscht wird. In diesem Fall können die Zu- und Abflusskapillaren an gegenüberliegenden Seiten eines Bildbrunnens ausgerichtet werden.

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Representative Results

Figure 1
Abbildung 1: Herstellung von Glasstäben für den Umgang mit Malpighian Tubules.
A - E. Prozess des Erhitzens und Ziehens einer Glasstange, um eine Verjüngung und Winkel geeignet für die Handhabung von MTs zu produzieren. Pfeile bezeichnen Richtung und Größe der Kraft angewendet werden. F. Foto eines entsprechend gefertigten Glaswerkzeugs. Maßstabsleiste = 10 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Dissektion von Adult Drosophila Anterior Malpighian Tubules.
A. Schematische Darstellung der vorderen MT-Entfernung mit 2 Paarfeinern in gekühltem Schneider-Medium. "A. Tubule" = Anterior MT. "P. Tubule" = posterior MT. B. Prozess des Abholens und Montierens von extrahierten MTs mit dünnen Glasstäben. C. Prozess der Einhaltung der gesamten Länge extrahierter MTs an einem Dia zur Bildgebung und physiologischen Beurteilung. D. Repräsentative Weitfeldbilder der SEpH -komponenten (470/510 nm ex/em) und mCherry (556/630 nm ex/em) von UAS-pHerry, angetrieben von capaR-GAL4, die gesunde vordere MTs darstellen, Vordere MTs, die durch unzureichende Perfusion beschädigt wurden, und falsch identifizierte hintere MTs. Beachten Sie, dass gesunde vordere MTs ein deutlich erweitertes blindes Anfangssegment aufweisen, ein verengtes Übergangssegment mit relativ erhöhter Expression von UAS-pHerry, wenn sie von capaR-GAL4angetrieben werden, und ein distales Hauptsegment. Beschädigte MTs zeigen spürbare Aggregate der mCherry Fluoreszenz ohne entsprechende SEpH-Fluoreszenz an. Hintere MTs sind einheitlich im Durchmesser ohne morphologisch unterschiedliche Segmente. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution Sigma-Aldrich P4832 Store at 4 °C, can be reused.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm Sigma-Aldrich GBL622105 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands Harbor Freight Tools 60501 Available from multiple vendors.
Schneider's Medium Fisher Scientific 21720024 Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps Fine Science Tools 11252-20 Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish Corning Life Sciences Fisher Scientific 08-757-100A Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides Corning Life Sciences 2949-75X25 Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm Warner Instruments 64-0796 Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Vacuum Silicone Grease Sigma-Aldrich Z273554 Available from multiple vendors.
Glass rods, 5 mm diameter delphiglass.com 9198 Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen Sigma-Aldrich Z377821 Available from multiple vendors.
Sealing Film Sigma-Aldrich P7668 Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube BD Falcon 352096 Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube BD Falcon 352070 Available from multiple vendors.
Dissecting Stereoscope Zeiss Discovery.V8 Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Rossano et al., 2017
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Terhzaz et al., 2012
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Sozen et al., 1997
Single-edged Carbon Steel Razor Blade Electron Microscopy Sciences 71960 Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder Fisher Scientific 16-04 Available from multiple vendors.
Bunsen Burner Fisher Scientific 50-110-1231 Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs Genesee Scientific 32-109BF Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket Fisher Scientific 07-210-129 Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips MidSci AV200 Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette Gilson Incorporated PIPETMAN P200 Available from multiple vendors.

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