ניתוח טובולה מאליפיאני מזבוב למבוגרים: בידוד אוסמורגולטוריה ואיבר הפרשה

Overview

מאמר זה מתאר את הניתוח של הצינוריות המלפיגיות (MT) מטיסת דרוזופילה נקבה ופרוטוקול לדוגמה מרוסאנו ואח '. (2017) שבו MTs מוכנים להדמיה חיה בתא זלוף.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך רוסאנו ורומרו, כימות אופטי של pH תאיים ב Drosophila melanogaster מלופיג'יאן Tubule Epithelia עם מחוון pH מקודד גנטית פלואורסצנט, J. Vis. Exp. (2017).

1. הכנת שקופיות פולי-ל-ליסין

1. צייר גבול של 40 x 20 מ"מ עם עט PAP הידרופובי סביב החלק העליון של שקופיות סטנדרטיות של 75 x 25 מ"מ והקצה לייבוש למשך 15 דקות ב- RT. השתמש בעט כיסויים גדול אם השקופיות אינן תואמות לאופטיקה הדמיה.
2. העבר 2 מ"ל של המניה 0.01% פולי-L-ליסין (PLL) פתרון על כל שקופית ולהניח בצד ב 1 שעה ב RT.
3. הסר PLL עודף עם פיפטה. שמור את הפתרון בבקבוקון חרוט של 50 מ"ל לשימוש עתידי. יש לאחסן ב-4 מעלות צלזיוס.
4. לשאוף כל פתרון שנותר עם קו ואקום. הפעל את קו הוואקום על פני כל משטח השקופית כדי להבטיח שלא יישאר פתרון בשקופיות.
5. הגדר את השקופיות בצד למשך שעה אחת נוספת ב- RT לפני השימוש. אחסן את השקופיות יבשות ב- RT למשך חודש אחד בספר שקופיות רגיל.

2. הכנת צלחת מנות ומוטות זכוכית

1. הוסף 0.5 מ"ל של חומר ריפוי אלסטומר ל 4.5 מ"ל של בסיס אלסטומר בצלחת פטרי פוליסטירן 35 x 10 מ"מ ב RT לייצר עומק של 5 מ"מ. מערבבים עם קצה פיפטה חד פעמי. אפשר לאלסטומר לרפא O/N ב RT.
   שים לב: אלסטומר צריך להיות ברור וללא בועות. ניקוי של בועות ניתן להקל על ידי שמירה על צלחות אלסטומר בצנצנת ואקום במשך 10 - 15 דקות לאחר שפיכה.
2. החזק מוט זכוכית בקוטר 5 מ"מ בין הידיים והמס את מרכז המוט מעל מבער בונזן מואר תוך כדי ניתוק הקצוות. ככל שהזכוכית נמסה, משוך מהר יותר כדי לייצר פיר דק (0.1 מ"מ) ופיר מחודד(איור 1).
   שים לב: זווית של 45 מעלות בשוק מועילה לעתים קרובות בטיפול בצינורות. ניתן להשיג זאת על ידי הנמכת יד אחת עם משיכת השוק (ראו איור 1).
3. לשבור את הפיר הדק באמצע עם הצד הקהה של להב סכין גילוח פלדה פחמן חד קצוות. בדוק את הקצה הדק של המוט תחת טווח ניתוח כדי להבטיח את ההפסקה נקייה.

3. ניתוח של צינורות מלופגיים נוטריוניים למבוגרים

1. לאסוף את צלחת דיסקציה ומשך מוט זכוכית מסעיף 2, שקופית מצופה PLL מסעיף 1, מחלק דבק זלוף היטב, שומן ואקום, 4 x 2" רצועה של סרט איטום, 2 זוגות של מלקחיים עדינים #5, ו 40 מ"ל aliquots של בינוני קר כקרח של שניידר ו RT iPBS.
2. מורחים שומן ואקום על סרט האיטום ולחץ על דבק זלוף היטב מחלק על הקלטת כדי לצפות את התחתית עם גריז. מקלפים את המפריד היטב זלוף דבק ומניחים אותו בצד גריז למטה על גבי שקופית מצופה PLL. הסר את מחלק באר זלוף להשאיר בארות דגימה בודדים נעוצים גריז הידרופובי.
3. הנח 200 μL של RT iPBS בשקופית המצופה בשומן והזז את השקופית מתחת לסטריאוסקופ.
4. מניחים את UAS-pHerry/capaR-GAL4 זבובים בבקבוקון זבוב ריק ומרדים אותם על קרח במשך 10 דקות.
   שים לב: שיטה זו של הרדמה, שלא כמו CO₂, מבטיח כי הזבובים לא להתייבש.
5. יוצקים את המדיום של שניידר קר כקרח לתוך צלחת הניתוח ומשתמשים במלקחיים עדינים כדי להעביר זבוב נקבה מורדם אחד לתוך המנה תחת סטריאוסקופ מנתח.
6. החזיקו את הזבוב ליד בית החזה עם סט של מלקחיים והשתמשו בשני כדי לאחוז בעדינות באחורי הבטן. משוך לפתוח את החלק האחורי של הזבוב באמצעות מלקחיים בתנועות קצרות ומכוונות. ברגע שההינדגוט נראה לעין, אחזו בקצה הדיסטלי ושחררו את המעיים וה-MTs מהקנה הנשימה שמתחת על ידי משיכת הישבנים מהגוף דרך משיכה קצרה וחוזרת על ההדק.
   שים לב: MTs האחורי והאחורי יהיה גלוי שבו הם פוגשים את הצומת של midgut ו hindgut דרך השופכן. הזוג הראשון של MTs להיות חופשי יהיה ככל הנראה tubules האחורי כפי שהם להקיף את hindgut. ניתן להתעלם מהם (איור 2A).
7. צבוט את הפסיכומטרי של השופך עם מלקחיים עדינים ברגע שהסט השני של ה- MTs נקי מהבטן. זה יפריד את הפסיכומטרי מהבטן ויסגור את השופך.
8. להרים את MTs חינם עם מוט זכוכית משך על ידי הזזת המוט מתחת לשופכה כך tubules ליפול משני הצדדים. הרם את ה- MTs ישר מהפתרון.
9. להפוך את מוט הזכוכית כך MTs ושופכה הם דבקים בחלק התחתון של המוט ולהוריד את השופכה ישר אל השקופית. הוסף את השופכך וחתום את קצות ה- MTs הדיסטליים על-ידי לחיצה על השופכה כלפי מטה אל שקופית הזכוכית(איור 2B). אין לתפעל את ה- MTs יותר מהנדרש. ה- MTs צריכים להיות צפים למעלה בתמיסה כאשר השופד מעוגן לשקופית.
10. השתמש בקצה הדק של מוט הזכוכית כדי לטאטא בעדינות כל צינור על פני משטח השקופית. הכן את המוט כנגד השקופית כדי למנוע ריסוק הצינור ולהחליק את המוט מעל החלק העליון של הצינורית, נע דיסטלי קרוב, כדי לחבר את האורך המלא של כל צינורית לפני השטח של שקופית PLL מצופה (איור 2C).
11. הנח את מחלק זלוף-היטב דבק בחזרה על המגלשה כדי ליצור באר קטנה מלא נוזלים מעל tubule רכוב.
12. מניחים את הדגימה על במת המיקרוסקופ. מקמו את נימי הזרימה והזרימה מעל פתחי הפתח והשקע של הזלוף היטב, בהתאמה.
    שים לב: ניתן להותיר את המפריד היטב כבוי אם רצוי תא זלוף פתוח. במקרה זה נימי הזרימה והזרימה יכולים להיות מיושרים לצדדים מנוגדים של באר הדמיה.

Representative Results

איור 1: ייצור מוטות זכוכית לטיפול בצינורות מלופיגיים.
A - E. תהליך חימום ומשיכת מוט זכוכית כדי לייצר התחדדות וזווית המתאימים לטיפול ב- MTs. חצים מציינים כיוון ועוצמת כוח שיש ליישם. F.תצלום של כלי זכוכית מפוברק כראוי. סרגל קנה מידה = 10 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ניתוח של צינורות מלופגיים נוטריוניים של דרוזופילה למבוגרים.
ייצוג סכמטי של הסרת MT לפני הים עם 2 זוגות מלקחיים משובחים במדיום של שניידר המצונן. "א. טובול" = MT. "P. Tubule" = MT. Bאחורי . תהליך אחזור והרכבה של MTs שחולצו באמצעות מוטות זכוכית דקים. C.תהליך של דבקות באורך המלא של MTs שחולצו לשקופית להדמיה והערכה פיזיולוגית. D.נציג תמונות שדה רחב של SEpH (470/510 ננומטר ex/em) ו mCherry (556/630 ננומטר ex/em) רכיבים של UAS-pHerry מונע על ידי capaR-GAL4 המתאר MTs פנים-ראשי בריא, MTs ראשיים שניזוקו על-ידי זלוף לא מספיק, ו- MTs אחוריים שזוהו באופן שגוי. MTs פגומים מציגים אגרגטים בולטים של פלואורסצנטיות של mCherry ללא פלואורסצנטיות SEpH תואמת. MTs אחוריים הם אחידים בקוטר ללא קטעים ברורים מורפולוגית. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution	Sigma-Aldrich	P4832	Store at 4 °C, can be reused.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Available from multiple vendors.
Schneider's Medium	Fisher Scientific	21720024	Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides	Corning Life Sciences	2949-75X25	Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Vacuum Silicone Grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Available from multiple vendors.
Glass rods, 5 mm diameter	delphiglass.com	9198	Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Available from multiple vendors.
Sealing Film	Sigma-Aldrich	P7668	Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube	BD Falcon	352096	Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube	BD Falcon	352070	Available from multiple vendors.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	Discovery.V8	Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Rossano et al., 2017
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Terhzaz et al., 2012
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Sozen et al., 1997
Single-edged Carbon Steel Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71960	Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder	Fisher Scientific	16-04	Available from multiple vendors.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket	Fisher Scientific	07-210-129	Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips	MidSci	AV200	Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Available from multiple vendors.