Dissezione del tubulo malpighiano da una mosca adulta: isolamento di un organo osmoregolatorio ed escretore

Overview

Questo articolo descrive la dissezione dei tubuli malpighiani anteriori (MT) da una mosca Drosophila femmina e un protocollo di esempio di Rossano et al. (2017) in cui le MT sono preparate per l'imaging dal vivo in una camera di perfusione.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Rossano e Romero, Quantificazione ottica del pH intracellulare in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia con un indicatore di pH fluorescente geneticamente codificato, J. Vis. Exp. (2017).

1. Preparazione di diapositive in poli-L-lisina

1. Disegnare un bordo di 40 x 20 mm con una penna PAP idrofobica intorno alla parte superiore dei vetrini standard da 75 x 25 mm e mettere da parte per asciugare per 15 minuti a RT. Utilizzare copertine di grandi dimensioni se le diapositive non sono compatibili con l'ottica di imaging.
2. Trasferire 2 mL di soluzione di poli-l-lisina (PLL) allo 0,01% su ogni scivolo e mettere da parte per 1 h a RT.
3. Rimuovere la PLL in eccesso con una pipetta. Salvare la soluzione in una fiala conica da 50 mL per un uso futuro. Conservare a 4 °C.
4. Aspirare qualsiasi soluzione rimanente con una linea di vuoto. Eseguire la linea del vuoto su tutta la superficie dello scivolo per assicurarsi che nessuna soluzione rimanga sulle diapositive.
5. Mettere da parte le diapositive per 1 h aggiuntivo a RT prima dell'uso. Conservare le diapositive asciutte su RT per un massimo di 1 mese in una slide book standard.

2. Preparazione di piatti di sezionatura e canne di vetro

1. Aggiungere 0,5 mL di agente polimerizzante elastomero a 4,5 mL di base di elastomero in una piastra di Petri in polistirolo da 35 x 10 mm a RT per produrre una profondità di 5 mm. Mescolare con una punta di pipetta usa e getta. Consentire all'elastomero di curare O/N a RT.
   NOTA: L'elastomero dovrebbe essere chiaro e privo di bolle. La pulizia delle bolle può essere facilitata mantenendo le piastre di elastomero in un barattolo sottovuoto per 10 - 15 minuti dopo il versamento.
2. Tenere un'asta di vetro di 5 mm di diametro tra le mani e sciogliere il centro dell'asta su un bruciatore Bunsen acceso mentre si allontanano le estremità. Quando il vetro si scioglie, tirare più rapidamente per produrre un albero sottile (0,1 mm) e affusolato(Figura 1).
   NOTA: Un angolo di 45 ° al gambo è spesso utile nella gestione dei tubuli. Ciò può essere ottenuto abbassando una mano man mano che il gambo viene tirato (vedere figura 1).
3. Rompere l'albero sottile al centro con il lato smussato di una lametta in acciaio al carbonio a taglio singolo. Ispezionare l'estremità sottile dell'asta sotto un mirino di sezionazione per assicurarsi che la rottura sia pulita.

3. Dissezione dei tubuli di Drosophila Anterior Malpighian adulti

1. Raccogliere la piastra di dissezione e l'asta di vetro tirata dalla sezione 2, uno scivolo rivestito in PLL dalla sezione 1, un divisore adesivo perfusione-pozzo, grasso sottovuoto, una striscia da 4 x 2" di pellicola di tenuta, 2 paia di pini fini #5 e 40 mL di media ghiacciata Schneider e RT iPBS.
2. Stendere il grasso sottovuoto sul nastro di tenuta e premere il divisore adesivo perfusione-pozzo sul nastro per rivestire il fondo con grasso. Staccare il divisore adesivo perfusione-pozzo e posizionarlo sul lato grasso verso il basso sopra uno scivolo rivestito in PLL. Rimuovere il divisore del pozzo di perfusione per lasciare i singoli pozzi del campione tracciati in grasso idrofobico.
3. Posizionare 200 μL di RT iPBS nel pozzo circondato da grasso sul vetrino rivestito in PLL e spostare lo scivolo sotto lo stereoscopio.
4. Posizionare le mosche UAS-pHerry/capaR-GAL4 in una fiala di mosca vuota e anestetizzarle sul ghiaccio per 10 minuti.
   NOTA: Questo metodo di anestesia, a differenza di CO₂, assicura che le mosche non si disidratano.
5. Versare il mezzo Schneider ghiacciato nella sezionatrice e utilizzare forcep fini per trasferire una singola mosca femminile anestetizzata nel piatto sotto uno stereoscopio sezionato.
6. Tenere la mosca vicino al torace con una serie di pinze e utilizzare l'altra per afferrare delicatamente il posteriore dell'addome. Apri il posteriore della mosca usando le forcep in brevi movimenti deliberati. Una volta visibile il broncio posteriore, afferrare l'estremità distale e liberare l'intestino e gli MT dai tracheoli sottostanti allontanando il broncio posteriore dal corpo attraverso rimorchiatori ripetitivi e brevi.
   NOTA: Gli MT anteriori e posteriori saranno visibili dove incontrano la giunzione del midgut e dell'hindgut attraverso l'ureter. La prima coppia di MT ad essere libera saranno probabilmente i tubuli posteriori mentre circondano il broncio posteriore. Questi possono essere ignorati(figura 2A).
7. Pizzicare le MT anteriori all'uretero con forcep fini una volta che il secondo set di MT è privo dell'addome. Questo separerà le MT anteriori dall'intestino e chiuderà l'otere.
8. Raccogliere i MT anteriori liberi con l'asta di vetro tirato facendo scorrere l'asta sotto l'ureter in modo che i tubuli cadano su entrambi i lati. Sollevare gli MT direttamente dalla soluzione.
9. Ruotare l'asta di vetro in modo che i MT e l'ureter siano aderenti alla parte inferiore dell'asta e abbassare l'ureter direttamente sullo scivolo. Apporre l'uretro e sigillare le estremità distali delle MT premendo l'ureter sul vetrino (Figura 2B). Non manipolare gli MT più del necessario. Gli MT dovrebbero fluttuare nella soluzione con l'ureter ancorato allo scivolo.
10. Utilizzare l'estremità fine dell'asta di vetro per spazzare delicatamente ogni tubulo sulla superficie dello scivolo. Rinforzare l'asta contro lo scivolo per evitare di frantumare il tubulo e far scorrere l'asta sopra la parte superiore del tubulo, spostando la distale in prossimale, per fissare l'intera lunghezza di ciascun tubulo alla superficie dello scivolo rivestito di PLL(figura 2C).
11. Riposizionare il divisore adesivo perfusione-pozzo sul vetrino per formare un piccolo pozzo riempito di fluido sopra il tubulo montato.
12. Posizionare il campione sul palco del microscopio. Posizionare i capillari di afflusso e deflusso sopra l'apertura di ingresso e uscita del pozzo di perfusione, rispettivamente.
    NOTA: Il divisore del pozzo può essere lasciato fuori se si desidera una camera di perfusione aperta. In questo caso i capillari di afflusso e deflusso possono essere allineati ai lati opposti di un pozzo di imaging.

Representative Results

Figura 1: Fabbricazione di aste di vetro per la movimentazione di tubuli malpighiani.
A - E. Processo di riscaldamento e trazione di un'asta di vetro per produrre un cono e un angolo adatti alla movimentazione di MT. Le frecce denotano la direzione e l'entità della forza da applicare. F. Fotografia di uno strumento di vetro opportunamente fabbricato. Barra di scala = 10 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Dissezione dei tubuli di Drosophila Anterior Malpighian adulti.
A. Rappresentazione schematica della rimozione anteriore dell'MT con 2 paia di forcep fini nel mezzo refrigerato di Schneider. "A. Tubule" = MT anteriore. Processo di recupero e montaggio di MT estratti utilizzando sottili aste di vetro. C. Processo di adesione dell'intera lunghezza delle MT estratte ad una diapositiva per l'imaging e la valutazione fisiologica. D. Immagini rappresentative a campo largo dei componenti SEpH (470/510 nm ex/em) e mCherry (556/630 nm ex/em) di UAS-pHerry guidati da capaR-GAL4 raffiguranti MT anteriori sani, MT anteriori danneggiati da perfusione insufficiente e MT posteriori erroneamente identificati. Si noti che gli MT anteriori sani mostrano un segmento iniziale cieco dilatato chiaro, un segmento di transizione ristretto con un'espressione relativamente maggiore di UAS-pHerry quando guidato da capaR-GAL4e un segmento principale distale. Gli MT danneggiati mostrano aggregati evidenti di fluorescenza mCherry senza fluorescenza SEpH corrispondente. Gli MT posteriori hanno un diametro uniforme senza segmenti morfologicamente distinti. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution	Sigma-Aldrich	P4832	Store at 4 °C, can be reused.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Available from multiple vendors.
Schneider's Medium	Fisher Scientific	21720024	Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides	Corning Life Sciences	2949-75X25	Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Vacuum Silicone Grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Available from multiple vendors.
Glass rods, 5 mm diameter	delphiglass.com	9198	Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Available from multiple vendors.
Sealing Film	Sigma-Aldrich	P7668	Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube	BD Falcon	352096	Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube	BD Falcon	352070	Available from multiple vendors.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	Discovery.V8	Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Rossano et al., 2017
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Terhzaz et al., 2012
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Sozen et al., 1997
Single-edged Carbon Steel Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71960	Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder	Fisher Scientific	16-04	Available from multiple vendors.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket	Fisher Scientific	07-210-129	Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips	MidSci	AV200	Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Available from multiple vendors.