大人のハエからのマルピギアンチューブ解剖:浸透圧と排泄器官の分離

Overview

この記事では、女性 ショウジョウバエ フライからの前マルピギアン細管(MT)の解剖とロッサーノらからのプロトコルの例を説明 しています。(2017)中に、MTが灌流室でのライブイメージングのために準備されている。

Protocol

このプロトコルは、ロッサーノとロメロからの抜粋であり、ショウジョウバエメラノガスターマルピヒアンチューブエピテリアにおける細胞内pHの光学定量化を蛍光遺伝学的にコード化されたpH指標、J.Vis. Exp.

1. ポリL-リジンスライドの調製

1. 標準の75 x 25 mmスライドの上部に疎水性のPAPペンを付けて40 x 20 mmの境界を描き、RTで15分間乾燥するようにしてください。
2. 2 mLのストック 0.01% ポリ L-リジン (PLL) 溶液を各スライドに移し、RT で 1 時間取っておきます。
3. ピペットで余分なPLLを取り除きます。将来の使用のために50 mLの円錐形のバイアルでソリューションを保存します。4 °Cで保管。
4. 真空ラインで残った溶液を吸引する。スライド表面全体に真空ラインを走り、スライド上にソリューションが残らないようにします。
5. 使用する前にRTで1つの追加のhのためにスライドを脇に置いてください。標準のスライドブックに最大1ヶ月間RTでスライドを乾燥させておきます。

2. ディッシュとガラス棒の解剖の準備

1. RTで35 x 10 mmポリスチレンペトリ皿のエラストマーベースの4.5 mLにエラストマー硬化剤の0.5 mLを加え、5mmの深さを作り出します。使い捨てのピペットチップと混ぜます。エラストマーがRTでO / Nを治すことを許可します。
   注: エラストマーは、泡の明確かつ自由でなければなりません。泡の除去は、エラストマープレートを注ぎ込んだ後10〜15分間真空瓶に入れておくことによって促進され得る。
2. 直径5mmのガラス棒を手の間に持ち、端を引き離しながら、点灯したブンゼンバーナーの上にロッドの中心を溶かします。ガラスが溶けるにつれて、より速く引っ張って薄い(0.1 mm)とテーパードシャフトを作り出す(図1)。
   注: シャンクでの45°の角度は、しばしば管状の取り扱いに有用である。これは、シャンクを引っ張る際に片手を下げることによって達成できます( 図1を参照)。
3. 単刃の炭素鋼カミソリブレードの鈍い側で真ん中の薄いシャフトを壊します。解剖スコープの下でロッドの薄い端を検査し、破断がきれいであることを確認します。

3. 成人 ショウジョウバエ 前部マルピギアン尿管の解剖

1. 解剖皿を収集し、セクション2からガラスロッドを引っ張り、セクション1からPLLコーティングスライド、接着剤灌流ウェルディバイダー、真空グリース、4 x 2"シールフィルムのストリップ、#5細かい鉗子の2ペア、および氷冷シュナイダーの媒体とRT iPBSの40 mLアリコート。
2. シールテープに真空グリースを広げ、接着剤灌流ウェルディバイダーをテープに押し込み、底部にグリースを塗ります。接着剤灌流ウェルディバイダーを剥がし、PLLコーティングスライドの上にグリースサイドダウンに置きます。灌流ウェルディバイダーを取り外し、疎水性グリースにトレースされた個々の標本井戸を残します。
3. PLLコーティングスライド上のグリース囲みウェルに200 μLのRT iPBSを配置し、ステレオスコープの下にスライドを移動します。
4. UAS-pHerry/capaR-GAL4は空のフライバイアルに飛び、氷の上で10分間麻酔します。
   注: この麻酔法は_、CO2とは異なり、ハエが脱水しないことを保証する。
5. 氷冷シュナイダーの媒体を解剖皿に注ぎ、細かい鉗子を使って解剖したステレオスコープの下で単一の麻酔をかけられた女性のハエを皿に移します。
6. 鉗子のセットで胸郭でフライを保持し、腹部の後部を優しくつかむために他を使用します。短く、意図的な動きで鉗子を使用してハエの後部を引っ張ります。後腸が見えたら、遠端をつかみ、繰り返し短い綱引きで後腸を体から引き離すことによって、下の気管から腸と腸を解放します。
   注:前部および後部の足は尿管を通して中間腸および後腸の接合部を満たすところに見える。彼らは後腸を囲むとして、解放されるMTの最初のペアは、おそらく後部管状になります。これらは無視できます (図 2A)。
7. 2番目のセットの中の中のMTが腹部から解放されたら、尿管の前部の中の前部の中を細かい鉗子でつまみ落とす。これは、腸から前の腸を分離し、尿管を閉じます.
8. 尿管の下のロッドを滑らせて、管状が両側に落ちるように引っ張られたガラス棒で自由な前の前のTを拾う。MTを溶液からまっすぐに持ち上げます。
9. ガラス棒を回して、そのMTと尿管をロッドの下側に付着させ、尿管をまっすぐ下げてスライドに下ろします。尿管を貼り付け、ガラススライド上に尿管を押し下げて、その中のMTの遠位端を密封する(図2B)。必要以上に、その MT を操作しないでください。このMTは、尿管をスライドに固定した溶液中に浮かんでいるはずです。
10. ガラス棒の細い端を使用して、スライド面を横切って各細管を静かに掃きます。管状を押しつぶさないようにロッドをスライドに対してブレースし、管状の上部にロッドをスライドさせ、遠位から近位まで移動し、PLLコーティングスライドの表面に各細管の全長を取り付ける(図2C)。
11. 接着剤灌流ウェルディバイダーをスライドに戻し、取り付けられた細管の上に小さな流体で満たされた井戸を形成します。
12. 標本を顕微鏡のステージに置きます。注入口と流出の毛細血管を、それぞれ灌流の入口と出口の開口部の上に配置します。
    注: ウェルディバイダーは、開いた灌流チャンバーが望まれる場合は、オフにすることができます。この場合、流入および流出キャピラリーは、イメージングの反対側にうまく整列することができる。

Representative Results

図1:マルピギ管を扱うガラス棒の製造
A - E.ガラス棒を加熱して引っ張って、テーパと、MTの取り扱いに適した角度を作り出すプロセス。 F.適切に製造されたガラス工具の写真。スケールバー= 10 mm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:成人 ショウジョウバエ 前部マルピギアン尿管の解剖
冷やされたシュナイダーの培地中の2組の細かい鉗子を用いた前MT除去の模式図。「A.チューブル」=前MT.「P.チューブル」=後方MT.薄いガラス棒を用いて抽出されたMTを取り出し、取り付けるプロセス。C.抽出された全長のMTを画像化および生理学的評価用のスライドに付着させるプロセス。健康な前足のMTを描いたcapaR-GAL4によって駆動されるUAS-pHerryのSEpH(470/510 nm ex/em)およびmCherry(556/630 nm ex/em)コンポーネントの代表的なワイドフィールド画像、 不十分な灌流によって損傷を受けた前部のMT、および誤認された後部MTs.健康な前部MTは、明確な拡張ブラインド初期セグメント、capaR-GAL4によって駆動されるUAS-pHerryの比較的増加した発現を有する収縮した移行セグメントおよび遠位主セグメントを示していることに注意してください。損傷したMTは、対応するSEpH蛍光を伴わないmCherry蛍光の顕著な凝集体を表示する。後部のMTは、形態学的に異なるセグメントを持たない直径が均一である。スケールバー= 50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution	Sigma-Aldrich	P4832	Store at 4 °C, can be reused.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Available from multiple vendors.
Schneider's Medium	Fisher Scientific	21720024	Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides	Corning Life Sciences	2949-75X25	Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Vacuum Silicone Grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Available from multiple vendors.
Glass rods, 5 mm diameter	delphiglass.com	9198	Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Available from multiple vendors.
Sealing Film	Sigma-Aldrich	P7668	Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube	BD Falcon	352096	Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube	BD Falcon	352070	Available from multiple vendors.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	Discovery.V8	Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Rossano et al., 2017
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Terhzaz et al., 2012
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Sozen et al., 1997
Single-edged Carbon Steel Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71960	Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder	Fisher Scientific	16-04	Available from multiple vendors.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket	Fisher Scientific	07-210-129	Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips	MidSci	AV200	Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Available from multiple vendors.