Malpighian Tubule Disección de una mosca adulta: Aislar un órgano osmoregulatorio y excretorio

Overview

Este artículo describe la disección de los túbulos malpighianos (MT) anteriores de una mosca Drosophila hembra y un protocolo de ejemplo de Rossano et al. (2017) en el que los MTs están preparados para imágenes en vivo en una cámara de perfusión.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Rossano y Romero, Cuantificación óptica del pH intracelular en Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia con un indicador de pH codificado genéticamente fluorescente, J. Vis. Exp. (2017).

1. Preparación de diapositivas de poli-L-lisina

1. Dibuje un borde de 40 x 20 mm con una pluma PAP hidrofóbica alrededor de la parte superior de las diapositivas estándar de 75 x 25 mm y reserve para secar durante 15 minutos en RT. Utilice grandes cubiertas si las diapositivas no son compatibles con la óptica de imágenes.
2. Transferir 2 mL de stock 0.01% Poly-L-Lisina (PLL) solución en cada diapositiva y reservar para 1 h en RT.
3. Retire el exceso de PLL con una pipeta. Guarde la solución en un vial cónico de 50 ml para su uso futuro. Conservar a 4 °C.
4. Aspirar cualquier solución restante con una línea de vacío. Ejecute la línea de vacío sobre toda la superficie de la diapositiva para asegurarse de que no quede ninguna solución en las diapositivas.
5. Reserve las diapositivas durante 1 h adicional en RT antes de su uso. Guarde las diapositivas secas en RT durante un mes en un libro de diapositivas estándar.

2. Preparación de la disección de platos y varillas de vidrio

1. Añadir 0,5 ml de agente de curado de elastómero a 4,5 ml de base de elastómero en una placa Petri de poliestireno de 35 x 10 mm a RT para producir una profundidad de 5 mm. Mezcle con una punta de pipeta desechable. Permita que el elastómero cure el quirófano en RT.
   NOTA: Elastómero debe ser claro y libre de burbujas. El despeje de burbujas puede facilitarse manteniendo las placas de elastómero en un frasco de vacío durante 10 - 15 minutos después de verter.
2. Sostenga una varilla de vidrio de 5 mm de diámetro entre las manos y derrita el centro de la varilla sobre un quemador Bunsen iluminado mientras separa los extremos. A medida que el vidrio se derrite tira más rápidamente para producir un eje delgado (0,1 mm) y cónico (Figura 1).
   NOTA: Un ángulo de 45 ° en el vástago es a menudo útil en el manejo de tubulos. Esto se puede lograr bajando una mano a medida que se tira del vástago (véase la Figura 1).
3. Rompa el eje delgado en el medio con el lado contundente de una hoja de afeitar de acero al carbono de un solo filo. Inspeccione el extremo delgado de la varilla bajo un alcance de disección para asegurarse de que la rotura esté limpia.

3. Disección de Drosophila Adulta Anterior Malpighian Tubules

1. Recoge el plato de disección y la varilla de vidrio extraída de la sección 2, un tobogán recubierto de PLL de la sección 1, un divisor de perfusión adhesivo, grasa de vacío, una tira de película de sellado de 4 x 2", 2 pares de fórceps finos #5 y 40 coácuotas de 40 ml de iPBS medianos y RT de Schneider helados.
2. Extienda la grasa de vacío en la cinta de sellado y presione el divisor adhesivo perfusión-pozo en la cinta para recubrir la parte inferior con grasa. Despega el divisor de perfusión adhesivo y colóquelo boca abajo en la parte superior de un tobogán recubierto de PLL. Retire el divisor del pozo de perfusión para dejar pozos de muestras individuales rastreados en grasa hidrofóbica.
3. Coloque 200 μL de RT iPBS en el pozo rodeado de grasa en la diapositiva recubierta PLL y mueva la diapositiva debajo del estereoscopio.
4. Coloque las moscas UAS-pHerry/capaR-GAL4 en un vial de mosca vacía y anestesándolas en hielo durante 10 minutos.
   NOTA: Este método de anestesia, a diferencia del CO_2,asegura que las moscas no se deshidraten.
5. Vierta el medio de Schneider helado en el plato de disección y use fórceps finos para transferir una sola mosca hembra anestesiada al plato bajo un estereoscopio diseccionador.
6. Sostenga la mosca junto al tórax con un conjunto de fórceps y use la otra para agarrar suavemente la parte posterior del abdomen. Abra la parte posterior de la mosca usando los fórceps en movimientos cortos y deliberados. Una vez que el hindgut es visible, agarre el extremo distal y libere el intestino y los MTs de las traqueoles subyacentes tirando del hindgut lejos del cuerpo a través de remolcadores repetitivos y breves.
   NOTA: Los MTs anteriores y posteriores serán visibles donde se encuentran con la unión del midgut y el hindgut a través del uréter. El primer par de MTs que serán libres probablemente serán los túbulos posteriores mientras rodean el hindgut. Estos pueden ser ignorados (Figura 2A).
7. Pellizque los MTs anteriores en el uréter con fórceps finos una vez que el segundo conjunto de MTs esté libre del abdomen. Esto separará los MTs anteriores del intestino y cerrará el uréter.
8. Recoge los MTs anteriores libres con la varilla de vidrio tirada deslizando la varilla debajo del uréter de tal forma que los túbulos caigan a ambos lados. Levante los MTs directamente fuera de la solución.
9. Gire la varilla de vidrio de tal forma que los MTs y el uréter se adhieran a la parte inferior de la varilla y bajen el uréter directamente hacia abajo en el tobogán. Coloque el uréter y selle los extremos distales de los MTs presionando el uréter hacia abajo en la diapositiva de vidrio (Figura 2B). No manipule los MTs más de lo necesario. Los MTs deben flotar en la solución con el uréter anclado a la diapositiva.
10. Utilice el extremo fino de la varilla de vidrio para barrer suavemente cada tubérculo a través de la superficie del tobogán. Sujetar la varilla contra el tobogán para evitar aplastar el tubérculo y deslizar la varilla sobre la parte superior del tubérculo, moviéndose distal a proximal, para fijar toda la longitud de cada tubérculo a la superficie del tobogán recubierto de PLL(Figura 2C).
11. Coloque el divisor de perfusión-pozo adhesivo de nuevo en el tobogán para formar un pequeño pozo lleno de líquido sobre el tubérculo montado.
12. Coloque el espécimen en el escenario del microscopio. Coloque los capilares de entrada y salida sobre la abertura de entrada y salida del pozo de perfusión, respectivamente.
    NOTA: El divisor del pozo se puede dejar apagado si se desea una cámara de perfusión abierta. En este caso, los capilares de entrada y salida se pueden alinear con lados opuestos de un pozo de imágenes.

Representative Results

Figura 1: Fabricación de varillas de vidrio para el manejo de tubulos malpighianos.
A - E. Proceso de calentamiento y extracción de una varilla de vidrio para producir una inclinación y ángulo adecuado para el manejo de MTs. Flechas denotan dirección y magnitud de fuerza a aplicar. F. Fotografía de una herramienta de vidrio adecuadamente fabricada. Barra de escala = 10 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Disección de Drosophila Anterior Malpighian Tubules adultos.
A. Representación esquemática de la eliminación anterior de MT con 2 pares de fórceps finos en el medio de Schneider refrigerado. "A. Tubule" = Mt anterior. "P. Tubule" = MT posterior B. Proceso de recuperación y montaje de MTs extraídos utilizando varillas de vidrio delgadas. C. Proceso de adherir toda la longitud de los MTs extraídos a una diapositiva para la toma de imágenes y la evaluación fisiológica. D. Imágenes representativas de campo ancho de los componentes SEpH (470/510 nm ex/em) y mCherry (556/630 nm ex/em) de UAS-pHerry conducidos por capaR-GAL4 que representan MTs anteriores sanos, MTs anteriores dañados por perfusión insuficiente, y MTs posteriores mal identificados. Los MTs dañados muestran agregados notables de fluorescencia mCherry sin fluorescencia SEpH correspondiente. Los MTs posteriores son uniformes en diámetro sin segmentos morfológicamente distintos. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution	Sigma-Aldrich	P4832	Store at 4 °C, can be reused.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Available from multiple vendors.
Schneider's Medium	Fisher Scientific	21720024	Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides	Corning Life Sciences	2949-75X25	Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Vacuum Silicone Grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Available from multiple vendors.
Glass rods, 5 mm diameter	delphiglass.com	9198	Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Available from multiple vendors.
Sealing Film	Sigma-Aldrich	P7668	Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube	BD Falcon	352096	Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube	BD Falcon	352070	Available from multiple vendors.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	Discovery.V8	Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Rossano et al., 2017
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Terhzaz et al., 2012
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Sozen et al., 1997
Single-edged Carbon Steel Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71960	Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder	Fisher Scientific	16-04	Available from multiple vendors.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket	Fisher Scientific	07-210-129	Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips	MidSci	AV200	Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Available from multiple vendors.