Malpighian Tubule Dissekering från en vuxenfluga: Isolera ett osmoregulatoriskt organ och utsöndringsorgan

Overview

Denna artikel beskriver dissekeringen av de främre malpighian tubules (MT) från en kvinnlig Drosophila flyga och ett exempel protokoll från Rossano et al. (2017) där MTs är förberedda för levande avbildning i en perfusionskammare.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Rossano och Romero, optisk kvantifiering av intracellulärt pH i Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia med en fluorescerande genetiskt kodad pH-indikator, J. Vis. Exp. (2017).

1. Förberedelse av poly-L-lysinbilder

1. Rita en 40 x 20 mm kant med en hydrofob PAP-penna runt toppen av standardbilder på 75 x 25 mm och ställ åt sidan för att torka i 15 minuter vid RT. Använd stora täcken om bilderna inte är kompatibla med bildoptik.
2. Överför 2 ml lager 0,01% Poly-L-Lysine (PLL) lösning på varje bild och ställ åt sidan i 1 h på RT.
3. Ta bort överflödig PLL med en pipett. Spara lösningen i en 50 ml konisk injektionsflaska för framtida användning. Förvaras vid 4 °C.
4. Aspirera på alla återstående lösningar med en vakuumledning. Kör vakuumledningen över hela glidytan för att säkerställa att ingen lösning finns kvar på bilderna.
5. Ställ bilderna åt sidan i ytterligare 1 timme på RT före användning. Förvara bilderna torra på RT i upp till 1 månad i en vanlig bildbok.

2. Beredning av dissekeringsfat och glasstavar

1. Tillsätt 0,5 ml elastomerhärdningsmedel till 4,5 ml elastomerbas i en 35 x 10 mm polystyren Petri-skål vid RT för att ge ett djup på 5 mm. Blanda med en engångspipettspets. Låt elastomer bota O/N på RT.
   OBS: Elastomer ska vara klar och fri från bubblor. Röjning av bubblor kan underlättas genom att hålla elastomerplattor i en vakuumburk i 10 -15 minuter efter hällning.
2. Håll en glasstav med diametern 5 mm mellan händerna och smält stångens mitt över en tänd Bunsenbrännare samtidigt som du drar isär ändarna. När glaset smälter drar det snabbare för att producera en tunn (0,1 mm) och avsmalnande axel (Figur 1).
   OBS: En 45 ° vinkel vid skaftet är ofta till hjälp vid hantering av tubuler. Detta kan uppnås genom att sänka en hand när skaftet dras (se figur 1).
3. Bryt den tunna axeln i mitten med den trubbiga sidan av ett enkantat rakblad i kolstål. Inspektera den tunna änden av stången under ett dissekeringsomfång för att säkerställa att brytningen är ren.

3. Dissekering av vuxna Drosophila Anterior Malpighian Tubules

1. Samla dissekeringsformen och dra glasstången från sektion 2, en PLL-belagd glidning från avsnitt 1, en självhäftande perfusionsbrunnsavdelare, vakuumfett, en 4 x 2" remsa av tätningsfilm, 2 par #5 fina tångar och 40 mL alikvoter av iskallt Schneiders medium och RT iPBS.
2. Sprid vakuumfett på tätningstejpen och tryck på den självhäftande perfusionsbrunnsavdelaren på tejpen för att täcka botten med fett. Skala av den självhäftande perfusionsbrunnsavdelaren och placera den fettsida ovanpå en PLL-belagd rutschkana. Ta bort perfusionsbrunnsavdelaren för att lämna enskilda provbrunnar spårade i hydrofobiskt fett.
3. Placera 200 μL RT iPBS i den fett omslutna brunnen på den PLL-belagda diabilden och flytta bilden under stereoskopet.
4. Placera UAS-pHerry/capaR-GAL4 flugor i en tom flugflaska och bedöva dem på is i 10 minuter.
   OBS: Denna anestesimetod, till skillnad från CO_2,säkerställer att flugorna inte dehydrerar.
5. Häll det iskalla Schneiders medium i dissekeringsfatet och använd fina tångar för att överföra en enda sövd honfluga i skålen under ett dissekerande stereoskop.
6. Håll flugan vid bröstkorgen med en uppsättning tång och använd den andra för att försiktigt greppa bukens bakre del. Dra upp flugan med tången i korta, avsiktliga rörelser. När hindguten är synlig, greppa den distala änden och befria tarmen och MTs från de underliggande luftstruparna genom att dra hindguten bort från kroppen genom repetitiva, korta bogserbåtar.
   OBS: De främre och bakre MTs kommer att vara synliga där de möter korsningen mellan midgut och hindgut genom ureter. Det första paret MTs som är fria kommer sannolikt att vara de bakre tubulerna när de omger hindguten. Dessa kan ignoreras (figur 2A).
7. Nyp av de främre MTs vid uretern med fina tångar när den andra uppsättningen MTs är fri från buken. Detta kommer att skilja de främre MTs från tarmen och stänga urinröret.
8. Plocka upp de fria främre MTs med den dragna glasstaven genom att skjuta stången under uretern så att tubulerna faller till vardera sidan. Lyft MTs rakt upp ur lösningen.
9. Vrid glasstaven så att MTs och ureter klibbas fast på undersidan av stången och sänk uretern rakt ner på rutschkanan. Fäst uretern och försegla de distala ändarna på MTs genom att trycka ner uretern på glasrutschbanan (Bild 2B). Manipulera inte MTs mer än nödvändigt. MTs ska flyta upp i lösningen med uretern förankrad i bilden.
10. Använd den fina änden av glasstaven för att försiktigt sopa varje tubule över glidytan. Håll stången mot glidningen för att undvika att krossa tubuleen och skjut stången över toppen av tubuleen, flytta distal till proximal, för att fästa hela längden på varje tubule på ytan av den PLL-belagda bilden (Figur 2C).
11. Placera den självhäftande perfusionsbrunnsavdelaren tillbaka på bilden för att bilda en liten vätskefylld brunn över den monterade tubuleen.
12. Placera provet på mikroskopstadiet. Placera in- och utflödes kapillärerna över perfusionsbrunnens inlopps- respektive utloppsöppning.
    OBS: Brunnsavdelaren kan lämnas av om en öppen perfusionskammare önskas. I detta fall kan in- och utflödes kapillärerna justeras mot motsatta sidor av en bildbrunn.

Representative Results

Figur 1: Tillverkning av glasstavar för hantering av malpighiska tubuler.
A - E. Process för uppvärmning och drag av en glasstav för att producera en kona och vinkel som är lämplig för hantering av MTs. Pilar betecknar riktning och kraftstorlek som ska appliceras. F.Fotografi av ett lämpligt tillverkat glasverktyg. Skalstreck = 10 mm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 2: Dissekering av vuxna Drosophila Anterior Malpighian Tubules.
A.Schematisk representation av främre MT-borttagning med 2 par fina tångar i kylda Schneiders medium. "A. Tubule" = Främre MT. "P. Tubule" = bakre MT. B. Process för hämtning och montering extraherade MTs med tunna glasstavar. C.Process för att vidhäfta hela längden på extraherade MTs till en glidning för bildbehandling och fysiologisk bedömning. D. Representativa widefieldbilder av SEpH-komponenterna (470/510 nm ex/em) och mCherry (556/630 nm ex/em) i UAS-pHerry som drivs av capaR-GAL4 och som visar friska främre MTs. främre MTs som skadats av otillräcklig perfusion, och felidentifierade bakre MTs. Observera att friska främre MTs visar ett tydligt dilaterat blind initialt segment, ett trängt övergångssegment med relativt ökat uttryck av UAS-pHerry när det drivs av capaR-GAL4, och ett distala huvudsegment. Skadade MTs visar märkbara aggregat av mCherry fluorescens utan motsvarande SEpH fluorescens. Bakre MTs är enhetliga i diameter utan morfologiskt distinkta segment. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution	Sigma-Aldrich	P4832	Store at 4 °C, can be reused.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Available from multiple vendors.
Schneider's Medium	Fisher Scientific	21720024	Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides	Corning Life Sciences	2949-75X25	Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Vacuum Silicone Grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Available from multiple vendors.
Glass rods, 5 mm diameter	delphiglass.com	9198	Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Available from multiple vendors.
Sealing Film	Sigma-Aldrich	P7668	Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube	BD Falcon	352096	Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube	BD Falcon	352070	Available from multiple vendors.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	Discovery.V8	Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Rossano et al., 2017
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Terhzaz et al., 2012
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Sozen et al., 1997
Single-edged Carbon Steel Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71960	Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder	Fisher Scientific	16-04	Available from multiple vendors.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket	Fisher Scientific	07-210-129	Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips	MidSci	AV200	Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Available from multiple vendors.