岛屿分析：评估 嗜血 性运动行为的高通量方法

Overview

此视频描述了岛屿检测，一种用于研究 嗜血 性运动的行为方法。示例协议具有与半自动图像分析兼容的检测设置。

Protocol

本协议摘自Eidhof等人的摘录，即 德罗索菲拉 岛测定中运动行为的高通量分析，J.Vis. Exp.（2017年）。

1. 建造岛屿测定箱

1. 准备一个由坚固材料（如聚甲基甲基酸酯 （PMMA） 制成的托盘，以包含一层水（即 浴缸）。确保材料不是白色的。
   注： 建议尺寸为 40 x 35 x 2.5 厘米³ （图 1A）。
2. 准备一个盒子（42 x 38 x 25 厘米^3），由坚固、透明的材料（如 PMMA）制成，放置在浴缸周围，以防止苍蝇逃入实验室空间。将一个洞（20 x 30厘米^2）放在横向侧，这个洞足够大，实验者可以用苍蝇轻松处理小瓶，并把它们扔到岛上（图1A）。
3. 准备一个高架平台 10 x 15 x 2.5 厘米³ 的尺寸，由防水材料 （PMMA 或塑料） 制成， 是防水的。
   注：此平台需要具有均匀的白色表面，以确保图像分析的良好对比度。大小不一定是固定的，但它应该足够大，以确保所有苍蝇最初降落在平台上，并有机会走在它（图1A）。
4. 将平台粘入浴缸或将重量或其他重物放入平台盒中，以防止平台在实验/拍摄过程中的位置变化，从而修复平台。

2. 软件要求和安装

1. 安装图像记录软件。
   1. 下载图像记录软件来记录岛屿图像系列（见 材料表），并将软件安装在计算机上。
      注： 此协议中描述的成像记录软件仅由 Windows 支持。其他用户的替代方案已添加到 材料表中。

3. 准备在岛屿分析中测试的苍蝇

1. 收集在寒冷或二氧化碳（CO_2）麻醉下的每个实验条件下的分阶段苍蝇，如前所述（在1-2天内）。
   1. 每个实验条件至少准备3个样品瓶，每个样本小瓶包含大约15只分阶段苍蝇。只使用翅膀完好无损、年龄和性别相似的苍蝇。
      注： 在此处描述的实验中，5个样本小瓶中含有15只雄性苍蝇的基因型^w-行动-加尔4/+（控制）和^w-Actin-Gal4/GD11950（tefu RNAi）在关闭当天收集，年龄为4天，用于执行岛屿检测。RNAi、控制菌株和 Actin-gal4 驱动程序是从商业来源获得的（参见 材料表）。
2. 让苍蝇恢复，以避免麻醉剂的影响（_{使用二氧化碳}时至少1天），然后测试收集的苍蝇在岛上检测的兴趣年龄。

4. 实验设置

注： 见 图1B。

1. 将冷水加入少量肥皂到浴盘中，并将平台放置在中间。
   注： 肥皂可降低水的表面张力：触摸水的苍蝇会淹死。这可以防止在实验过程中有越来越多的苍蝇在盒子里飞行。
2. 将透明盒子放在托盘顶部，并用灯从上面照亮平台。
   注： 主要要求对平台进行照明，以确保适当的视频对比度。普通的 12V LED 灯适合此。
3. 将网络摄像头直接放置在平台上方（框外），并将其连接到计算机。
4. 在计算机上创建新的文件夹，以便在实验之前存储不同的实验数据。
   1. 按照 图 2A 中示例的结构创建文件夹。例如，如果实验设计需要测试两个基因型，每个基因型有五个复制品，则首先创建一个包含实验日期的主文件夹。在主文件夹内，创建两个子文件夹（每个基因型一个）。在基因型文件夹内，创建五个新的子文件夹，每个副本一个。
      注： 为了进一步分析，必须将与单个实验相对应的图像系列保存在具有独特名称的文件夹中。

5. 界面"捕获设备"部分的视频设置

1. 打开图像记录软件，并在"捕获"选项卡下单击"延时图像..."并选择合适的网络摄像头作为"捕获设备"。
2. 在岛上放一只死苍蝇;通过单击"视频设置"框来调整视频设置。滚动浏览工具栏，调整亮度、对比度和颜色，使死苍蝇在白色背景上呈黑色（图 2B）。调整完成后，单击"确定"。

6. 在界面的"延时"部分设置录制和视频保存设置

1. 调整"延时电影设置"中的设置，将实验保存为.avi文件。单击"浏览。。。"，选择将存储电影的目录，定义视频名称，然后按"保存"。
   注： 视频文件不用于数据的量化：然而，获得关于实验的总体想法可能是有用的。
2. 调整"延时电影设置"部分的设置。
   1. 在压缩框中，选择"英特尔 IYUV 代码"进行视频压缩，并选择"每 0.1 秒拍摄一帧"，其"播放速率（图像每秒）："为 10。
   2. 通过单击"高级..."，将实验时间系列保存为.bmp帧选择"为每个捕获的帧创建一个.bmp图像"。单击"浏览"。在"AVI 电影拍摄期间"窗口中选择相同的目录（如步骤 6.1 中选择），单击"打开"，然后按"确定"。
      注： 请注意，在实验期间，帧存储为.bmp文件（数据分析所必需）。程序将帧命名为"A"，然后是与帧捕获序列对应的数字（例如，"A_number.bmp"）（图 2C）。始终在新文件夹中保存属于不同实验的图像，以确保以前录制的图像系列不会被覆盖。请注意，除非在"浏览..."下选择此文件夹，否则图像不会自动保存在视频文件的同一文件夹中。单击"高级"框后。

7. 岛屿分析和数据收集

1. 按图像录制软件的延时图像界面中的启动按钮开始录制。
2. 点击包含苍蝇的实验小瓶（第 3 步）2-3 次，以确保苍蝇位于小瓶底部。快速取出小瓶的插头，用有力的运动，轻点平台上的小瓶，使所有苍蝇同时掉到平台上（图1C）。
3. 大约 30 后，按下"停止"按钮停止录制。
   注： 如果所有苍蝇都从平台上消失，则可以更早地停止录制。
4. 停止图像录制后，用手取出平台上停留 30s 的苍蝇。
5. 在继续录制下一个实验之前，更改.bmp文件和电影的目标目录（见第 6 节）。

Representative Results

图1：流程图概述了岛屿测定的要求、实验过程和分析。 （A） 岛屿检测设备。（B） 岛屿检测的实验设置。（C） 岛屿检测。（D） 使用"德罗索菲拉 岛分析"宏处理岛屿检测数据。"德罗索菲拉 岛测定"宏由3个子宏组成：1）堆栈和投影，2）定义平台，3）分析。（E） 使用"岛屿分析"脚本处理和统计评估数据。 请单击此处查看此图的更大版本。

图2：协议期间需要进行不同调整的示例。 （A） 必须存储岛屿分析实验以进行数据处理和分析所需的目录结构。（B） 调整视频设置时，苍蝇必须在白色背景上显示为黑色。（C） 本手稿中描述的图像记录软件保存的图像帧输出文件。（D） 黄色轮廓显示平台选择。"投资回报率经理"中存储的平台选择以蓝色突出显示。（E） 苍蝇在调整"最小苍蝇大小设置"时被表示为白点。结果窗口以像素显示苍蝇的区域。（F） 单个记录图像帧（左侧）和生成图像堆栈中的相应帧的示例，通过"德罗索菲拉 岛分析"宏（右侧）获得。 请单击此处查看此图的更大版本。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 x 95 mm Drosophila vials	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 HD Webcam	Logitech	-	Any webcam with USB connection is suitable.
Stand to hold webcam	-	-	-
Lamp	-	-	12 V LED lights are appropriate
Pounding pad	-	-	Any mouse pad works
Island Assay box	-	-	Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.
Island Assay bath	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Non white.
Island/platform	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.
Soap	-	-	Standard dishwashing detergent is suitable.
Computer	-	-	Scripts run both on Windows and Mac
Image-recording software: HandiAvi®	AZcendant®	-	HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)
Image-recording software: WebcamCapture	-	-	Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting.