섬 분석: 드로소필라 로코모터 동작을 평가하는 고처리량 방법

Overview

이 비디오는 드로소필라 운동을 연구하는 데 사용되는 행동 방법인 섬 분석법을 설명합니다. 샘플 프로토콜에는 반자동 이미지 분석과 호환되는 분석용 설정이 포함되어 있습니다.

Protocol

이 프로토콜은 Drosophila 섬 분석, J. Vis. Exp. (2017)에서 로코모터 행동의 높은 처리량 분석 에서 발췌.

1. 섬 분석 상자 의 건설

1. 폴리 메틸 메타크릴레이트(PMMA)와 같은 견고한 소재로 만든 트레이를 준비하여물층(즉, 목욕)을 포함합니다. 재질이 흰색이 아닌지 확인합니다.
   참고: 40 x 35 x 2.5 cm^3의 치수는 권장됩니다(그림 1A).
2. PMMA와 같은 견고하고 투명한 소재로 만든 상자(42 x 38 x 25cm^3)를준비하여 파리가 실험실 공간으로 빠져나가는 것을 방지합니다. 실험자가 파리로 바이알을 쉽게 처리하고 섬에 떨어뜨릴 수 있을 만큼 충분히 큰 측면(20 x 30cm^2)에구멍을 놓습니다(그림1A).
3. 방수 처리성 재료(PMMA 또는 플라스틱)로 만든 높은 플랫폼 10 x 15 x 2.5cm^3을 치수로 준비합니다.
   참고: 이 플랫폼은 이미지 분석에 대한 좋은 대비를 보장하기 위해 균일한 흰색 표면을 가져야 합니다. 크기는 반드시 고정되지 는 않지만 모든 파리가 처음에 플랫폼에 착륙하고 걸을 수있는 기회를 얻을 수 있도록 충분히 커야합니다(그림 1A).
4. 실험/촬영 세션 동안 플랫폼의 위치 변경을 방지하기 위해 욕조에 접착하거나 플랫폼 상자 안에 가중치 또는 기타 무거운 물체를 배치하여 플랫폼을 수정합니다.

2. 소프트웨어 요구 사항 및 설치

1. 이미지 녹음 소프트웨어의 설치.
   1. 이미지 녹음 소프트웨어를 다운로드하여 섬 이미지 시리즈를 기록하고(자료 표참조) 컴퓨터에 소프트웨어를 설치합니다.
      참고: 이 프로토콜에 설명된 이미징 기록 소프트웨어는 Windows에서만 지원됩니다. 다른 사용자에 대한 대안이 재료 표에추가되었습니다.

3. 섬 분석에서 테스트 할 파리의 준비

1. 이전에 설명한 바와 같이 감기 또는_{이산화탄소(CO2)}마취 하에서 각 실험 조건에 대해 준비된 파리를 수집합니다(1 -2 일의 기간 동안).
   1. 실험 조건당 최소 3개의 시료 바이알을 준비하며, 각각 약 15개의 단계별 파리를 함유하고 있습니다. 그대로 날개가 있는 파리만 사용하며, 이와 비슷한 연령과 성별입니다.
      참고: 여기에 기술된 실험의 경우, 유전자형의 15마리의 수컷 파리를 포함하는 5개의 샘플^바이알-; 액틴-갈4/+ (컨트롤) 및 w^-; 액틴 갈4/GD11950(테푸 RNAi)은 4일 동안 숙성된 백과리 당일에 수집되었으며, 섬 분석법을 수행하는 데 사용되었다. RNAi, 제어 균주, 액틴 갈4 드라이버는 상업 소스에서 얻었다 (재료의 표참조).
2. 관심의 나이에 섬 분석에서 수집 된 파리를 테스트하기 전에 마취제 (CO_2를사용할 때 적어도 1 일)의 효과를 피하기 위해 파리를 복구할 수 있습니다.

4. 실험 설정

참고: 그림 1B를참조하십시오.

1. 소량의 비누로 차가운 물을 목욕 트레이에 넣고 플랫폼을 중간에 배치합니다.
   참고: 비누는 물의 표면 장력을 감소시다. 물을 만지는 파리가 익사합니다. 이렇게 하면 실험 세션이 진행되는 동안 상자에서 날아다니는 파리의 양이 증가합니다.
2. 투명 상자를 트레이 위에 놓고 램프를 사용하여 위에서 플랫폼을 비춥니다.
   참고: 플랫폼의 조명은 주로 적절한 비디오 대비를 보장하기 위해 필요합니다. 일반 12-V LED 표시등이 적합합니다.
3. 웹캠을 플랫폼 바로 위에 배치하고(상자 외부) 컴퓨터에 연결합니다.
4. 실험 전에 다른 실험 데이터를 저장하기 위해 컴퓨터에 새 폴더를 만듭니다.
   1. 그림 2A에 도시된 예제의 구조를 따라 폴더를 만듭니다. 예를 들어 실험 설계에 각각 5개의 복제가 있는 두 개의 유전자형을 테스트해야 하는 경우 먼저 실험 날짜를 포함하는 주 폴더를 만듭니다. 메인 폴더 내부에 두 개의 하위 폴더(유전자형당 하나)를 만듭니다. 유전자형 폴더 내부에 복제당 하나씩 5개의 새 하위 폴더를 만듭니다.
      참고: 추가 분석을 위해서는 개별 실험에 해당하는 이미지 계열을 고유한 이름이 있는 폴더에 저장해야 합니다.

5. 인터페이스의 "캡처 장치" 섹션의 비디오 설정

1. 이미지 녹화 소프트웨어를 열고 "캡처" 탭 아래에서 "시간 경과 이미지..." 적절한 웹캠을 "캡처 장치"로 선택합니다.
2. 섬에 죽은 비행을 배치; "비디오 설정" 상자를 클릭하여 비디오 설정을 조정합니다. 공구 막대를 스크롤하여 데드 플라이가 흰색배경(그림 2B)에검은색으로 표시되는 방식으로 밝기, 대비 및 색상을 조정합니다. 조정이 완료되면 "확인"을 클릭합니다.

6. 인터페이스의 "시간 경과"섹션에서 녹화 및 비디오 저장 설정 설정

1. "시간 경과 동영상 설정"의 설정을 조정하여 실험을 .avi 파일로 저장합니다. "찾아보기..."를 클릭하고, 동영상이 저장될 디렉토리를 선택하고, 비디오 이름을 정의하고, "저장"을 누릅니다.
   참고: 비디오 파일은 데이터의 정량화에 사용되지 않습니다. 그러나 실험에 대한 전반적인 아이디어를 얻는 것이 유용할 수 있습니다.
2. "타임랩스 무비 설정" 섹션에서 설정을 조정합니다.
   1. 압축 상자에서 비디오 압축을 위해 "인텔 IYUV 코드"를 선택하고 10에서 "재생 속도(초당 이미지)"를 통해 "0.1초마다 한 프레임 가져 가라"를 선택합니다.
   2. "고급..."을 클릭하여 실험 타임 시리즈를 .bmp 프레임으로 저장합니다. "캡처된 각 프레임에 대해 .bmp 이미지 만들기"를 선택합니다. "찾아보기"를 클릭합니다. "AVI 동영상 캡처 중" 창에서 동일한 디렉토리를 선택하고(6.1단계에서 선택됨)를 클릭하고 "열기"를 클릭하고 "확인"을 누릅니다.
      참고: 실험 중에 프레임이 .bmp 파일로 저장됩니다(데이터 분석에 필요한). 이 프로그램은 프레임을 "A"로 그 다음으로 프레임 캡처 시퀀스(예: "A_number.bmp")(그림2C)에해당합니다. 이전에 기록된 이미지 시리즈가 덮어쓰지 않도록 항상 다른 실험에 속한 이미지를 새 폴더에 저장합니다. 이 폴더가 "찾아보기..." 아래에 선택되지 않는 한 이미지가 비디오 파일과 동일한 폴더에 자동으로 저장되지 않는다는 점에 유의하십시오. "고급" 상자를 클릭하면 됩니다.

7. 아일랜드 분석 및 데이터 수집

1. 이미지 레코딩 소프트웨어의 타임랩스 이미지 인터페이스에서 시작 버튼을 눌러 레코딩을 시작합니다.
2. 파리 (3 단계) 2-3 번 포함하는 실험 용유리를 눌러 파리가 유리병의 바닥에 있는지 확인합니다. 유리병의 플러그를 빠르게 제거하고, 격렬한 움직임으로, 모든 파리가 동시에 플랫폼에 떨어질 수 있도록 플랫폼에서 유리병을 누릅니다(그림 1C).
3. 약 30s 후, 녹음을 중지 "중지"버튼을 누릅니다.
   참고: 모든 파리가 플랫폼에서 사라지면 녹화를 더 일찍 중지할 수 있습니다.
4. 이미지 녹화를 중지한 후 플랫폼에서 30s에 남아 있는 파리를 손으로 제거합니다.
5. 다음 실험을 계속하기 전에 .bmp 파일 및 영화의 대상 디렉터리를 변경합니다(섹션 6 참조).

Representative Results

그림 1: 플로차트는 섬 분석의 요구 사항, 실험 절차 및 분석을 요약합니다. (A)섬 분석 장비. (B)섬 분석에 대한 실험 적 설정. (C)섬 분석. (D)"드로소필라 섬 분석" 매크로와 섬 분석 데이터의 처리. "Drosophila 섬 분석" 매크로는 3 개의 하위 매크로로 구성됩니다 : 1) 스택 및 프로젝션, 2) 플랫폼 정의 및 3) 분석. (E)"섬 분석" 스크립트를 사용하여 데이터의 처리 및 통계 평가를 처리합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 프로토콜 중에 필요한 다양한 조정의 예입니다. (A)데이터 처리 및 분석을 위해 섬 분석 실험을 저장해야 하는 필수 디렉터리 구조입니다. (B)비디오 설정을 조정할 때 파리는 흰색 배경에 검은색으로 표시되어야 합니다. (C)이 원고에 설명된 이미지 기록 소프트웨어에 의해 저장된 이미지 프레임 출력 파일. (D)노란색 윤곽선은 플랫폼 선택을 표시합니다. "ROI 관리자"의 저장된 플랫폼 선택은 파란색으로 강조 표시됩니다. (E)파리는 "최소 비행 크기 설정"을 조정하는 동안 흰색 점으로 표시됩니다. 결과 창은 플라이의 영역을 픽셀 단위로 표시합니다. (F)하나의 기록된 이미지 프레임(왼쪽)과 결과 이미지 스택의 해당 프레임의 예는"드로소필라 섬 분석" 매크로(오른쪽)로 얻어진다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 x 95 mm Drosophila vials	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 HD Webcam	Logitech	-	Any webcam with USB connection is suitable.
Stand to hold webcam	-	-	-
Lamp	-	-	12 V LED lights are appropriate
Pounding pad	-	-	Any mouse pad works
Island Assay box	-	-	Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.
Island Assay bath	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Non white.
Island/platform	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.
Soap	-	-	Standard dishwashing detergent is suitable.
Computer	-	-	Scripts run both on Windows and Mac
Image-recording software: HandiAvi®	AZcendant®	-	HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)
Image-recording software: WebcamCapture	-	-	Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting.