Island Assay: En høy gjennomstrømningsmetode for å evaluere Drosophila Locomotor Behavior

Overview

Denne videoen beskriver øyanalysen, en atferdsmetode som brukes til å studere Drosophila-bevegelse. Eksempelprotokollen har et oppsett for analysen som er kompatibel med halvautomatisk bildeanalyse.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Eidhof et al.,High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay, J. Vis. Exp. (2017).

1. Bygging av øya assay box

1. Forbered et brett laget av et robust materiale, for eksempel polymetylmetakrylat (PMMA), for å inneholde et lag med vann (dvs. et bad). Pass på at materialet ikke er hvitt.
   MERK: Dimensjoner på 40 x 35 x 2,5 cm³ anbefales (Figur 1A).
2. Forbered en boks (42 x 38 x 25 cm³) laget av et robust, gjennomsiktig materiale, for eksempel PMMA, som skal plasseres rundt badekaret for å forhindre at fluene slipper ut i laboratorierommet. Plasser et hull (20 x 30 cm²) på sidesiden som er stor nok til at eksperimentet enkelt kan håndtere hetteglassene med fluer og slippe dem på øya (Figur 1A).
3. Forbered en forhøyet plattform 10 x 15 x 2,5 cm³ i dimensjon, laget av et ugjennomtrengelig materiale (PMMA eller plast) som er vanntett.
   MERK: Denne plattformen er nødvendig for å ha en jevn hvit overflate for å sikre god kontrast for bildeanalyse. Størrelsen er ikke nødvendigvis fast, men den skal være stor nok til å sikre at alle fluer i utgangspunktet lander på plattformen og får sjansen til å gå på den (Figur 1A).
4. Fest plattformen ved å lime den inn i badekaret eller plassere vekter eller andre tunge gjenstander inne i plattformboksen for å forhindre posisjonsendringer på plattformen under eksperimentell / filming.

2. Programvarekrav og installasjon

1. Installasjon av programvare for avbildningsopptak.
   1. Last ned programvare for bildeopptak for å spille inn bildeserien på øya (se Materialfortegnelsen) og installer programvaren på en datamaskin.
      MERK: Bildebehandlingsopptaksprogramvaren som er beskrevet i denne protokollen, støttes bare av Windows. Et alternativ for andre brukere er lagt til i materialfortegnelsen.

3. Forberedelse av fluene som skal testes i øyanalysen

1. Samle iscenesatte fluer for hver eksperimentell tilstand under kaldt eller karbondioksid (CO₂) anestesi, som tidligere beskrevet (over en periode på 1 - 2 dager).
   1. Forbered minst 3 prøve hetteglass per eksperimentell tilstand, som hver inneholder ca. 15 iscenesatte fluer. Bruk bare fluer med intakte vinger og som er av lignende alder og kjønn.
      MERK: For forsøkene som er beskrevet her, 5 prøve hetteglass som inneholder 15 mannlige fluer av genotypene m^-; Actin-Gal4/+ (kontroll) og w^-; Actin-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) ble samlet inn på eklosjonsdagen, i en alder av 4 dager, og ble brukt til å utføre øyanalysen. RNAi, kontrollstammer og Actin-gal4-sjåføren ble hentet fra en kommersiell kilde (se materialtabellen).
2. La fluene komme seg for å unngå effekter fra bedøvelsen (minst 1 dag ved bruk av CO₂) før du tester de innsamlede fluene i øyanalysen i en alder av interesse.

4. Eksperimentelt oppsett

MERK: Se figur 1B.

1. Tilsett kaldt vann med en liten mengde såpe til badebrettet og plasser plattformen i midten.
   MERK: Såpen reduserer overflatespenningen i vannet; fluer som berører vannet vil drukne. Dette forhindrer økende mengder fluer som flyr i boksen under progresjonen av den eksperimentelle økten.
2. Plasser den gjennomsiktige boksen på toppen av brettet og belys plattformen ovenfra ved hjelp av en lampe.
   MERK: Belysning av plattformen er hovedsakelig nødvendig for å sikre riktig videokontrast. Et vanlig 12-V LED-lys passer for dette.
3. Plasser webkameraet rett over plattformen (utenfor boksen) og koble det til en datamaskin.
4. Opprett nye mapper på datamaskinen for å lagre de forskjellige eksperimentelle dataene før eksperimentene.
   1. Følg strukturen i eksemplet illustrert i figur 2A for å opprette mappene. Hvis for eksempel den eksperimentelle utformingen krever testing av to genotyper med fem replikerer hver, oppretter du først en hovedmappe som inneholder datoen for eksperimentet. Opprett to undermapper i hovedmappen (én per genotype). Opprett fem nye undermapper i genotypemappene, én per replikering.
      MERK: For videre analyse er det viktig at bildeserien som tilsvarer individuelle eksperimenter lagres i mapper med unike navn.

5. Oppsett av videoinnstillinger i delen "Opptaksenhet" i grensesnittet

1. Åpne bildeopptaksprogramvaren, og klikk på "Time-Lapse Images..." under "Capture" -fanen. og velg riktig webkamera som "Capture Device".
2. Plasser en død flue på øya; juster videoinnstillingene ved å klikke på "Videoinnstillinger" -boksen. Bla gjennom verktøylinjene, juster lysstyrke, kontrast og farge på en slik måte at den døde fluen vises svart på hvit bakgrunn (Figur 2B). Når justeringene er fullført, klikker du ok.

6. Oppsett av innspillings- og videolagringsinnstillinger i delen "Tidsforløp" i grensesnittet

1. Juster innstillingene i "Time-Lapse Movie Setup" for å lagre eksperimentet som en .avi fil. Klikk på "Bla gjennom ...", velg katalogen der filmen skal lagres, definer navnet på videoen, og trykk "lagre".
   MERK: Videofilen brukes ikke til kvantifisering av data; Det kan imidlertid være nyttig å få en generell ide om eksperimentet.
2. Juster innstillingene i delen "Oppsett av tidsforløpfilm".
   1. I komprimeringsboksen velger du "Intel IYUV-kode" for videokomprimering og velger "Ta ett bilde hvert 0.1 sekund", med "Play-back rate (bilder per sekund):" ved 10.
   2. Lagre eksperimenttidsseriene som .bmp rammer ved å klikke på "Avansert ..." Velg "Lag et .bmp bilde for hver fangede ramme". Klikk på "Bla gjennom". Velg den samme katalogen i vinduet "Under AVI-filmopptak" (som valgt i trinn 6.1), klikk "Åpne", og trykk "Ok".
      MERK: Legg merke til at under eksperimentet lagres rammene som .bmp filer (kreves for dataanalyse). Programmet navngir rammene som "A" etterfulgt av nummeret som tilsvarer rammefangstsekvensen (for eksempel"A_number.bmp") (Figur 2C). Lagre alltid bildene som tilhører forskjellige eksperimenter i en ny mappe, for å sikre at tidligere innspilte bildeserier ikke overskrives. Vær oppmerksom på at bildene ikke automatisk lagres i samme mappe som videofilen, med mindre denne mappen er valgt under "Bla gjennom ..." ved å klikke på "Avansert" -boksen.

7. Øyanalyse og datainnsamling

1. Trykk på startknappen i tidsforløpbildegrensesnittet til bildeopptaksprogramvaren for å starte innspillingen.
2. Trykk på det eksperimentelle hetteglasset som inneholder fluer (trinn 3) 2-3 ganger for å sikre at fluene er på bunnen av hetteglasset. Fjern raskt hetteglassets støpsel og, med en kraftig bevegelse, trykk på hetteglasset på plattformen slik at alle fluer faller på plattformen samtidig (Figur 1C).
3. Etter ca. 30 s trykker du på "Stopp" -knappen for å stoppe opptaket.
   MERK: Hvis alle fluer forsvinner fra plattformen, kan opptaket stoppes tidligere.
4. Fjern fluene som forblir i 30 s på plattformen for hånd etter å ha stoppet bildeopptaket.
5. Før du fortsetter å spille inn neste eksperiment, må du endre målkatalogen for .bmp filer og filmer (se avsnitt 6).

Representative Results

Figur 1: Flytskjema som skisserer kravene, eksperimentell prosedyre og analyse av øyanalysen. (A) Analyseutstyr på øya. (B) Eksperimentelt oppsett for øyanalysen. (C) Øyanalyse. (D) Behandling av øyanalysedata med makroen"Drosophila Island Assay". Makroen"Drosophila Island Assay" består av 3 undermakroer: 1) gjør stakk og projeksjon, 2) definere plattform og 3) analyse. (E) Behandling og statistisk evaluering av data ved hjelp av skriptet "Island Assay Analysis". Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Eksempler på ulike justeringer som kreves under protokollen. (A) Den nødvendige katalogstrukturen der øyanalyseeksperimenter må lagres for databehandling og analyse. (B) Når du justerer videoinnstillingene, må fluer vises svart på hvit bakgrunn. (C) Bilderamme utdatafiler som lagret av bildeopptak programvare beskrevet i dette manuskriptet. (D) Den gule omrisset viser plattformvalget. Det lagrede plattformvalget i "ROI Manager" er uthevet i blått. (E) Fluer representeres som hvite prikker under justeringen av innstillingen "Minimum flystørrelse". Resultatvinduet viser området av fluene i piksler. (F) Eksempel på en enkelt innspilt bilderamme (til venstre) og den tilsvarende rammen i den resulterende bildestakken, oppnådd med makroen "Drosophila Island Assay" (til høyre). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 x 95 mm Drosophila vials	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 HD Webcam	Logitech	-	Any webcam with USB connection is suitable.
Stand to hold webcam	-	-	-
Lamp	-	-	12 V LED lights are appropriate
Pounding pad	-	-	Any mouse pad works
Island Assay box	-	-	Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.
Island Assay bath	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Non white.
Island/platform	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.
Soap	-	-	Standard dishwashing detergent is suitable.
Computer	-	-	Scripts run both on Windows and Mac
Image-recording software: HandiAvi®	AZcendant®	-	HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)
Image-recording software: WebcamCapture	-	-	Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting.