Ensaio da Ilha: Um Método de Alto Rendimento para Avaliar o Comportamento Locomotor de Drosophila

Overview

Este vídeo descreve o ensaio da ilha, um método comportamental usado para estudar a locomoção de Drosophila. O protocolo de amostra apresenta uma configuração para o ensaio compatível com análise de imagem semi-automatizada.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Eidhof et al., High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay, J. Vis. Exp. (2017).

1. Construção da Caixa de Ensaio da Ilha

1. Prepare uma bandeja feita de um material robusto, como o poli metil metil methacrilato (PMMA), para conter uma camada de água (ou seja, um banho). Certifique-se de que o material não é branco.
   NOTA: São recomendadas dimensões de 40 x 35 x 2,5 cm³ (Figura 1A).
2. Prepare uma caixa (42 x 38 x 25 cm³) feita de um material robusto e transparente, como o PMMA, para ser colocada ao redor do banho para evitar que as moscas escapem para o espaço do laboratório. Coloque um orifício (20 x 30 cm²) no lado lateral que seja grande o suficiente para o experimentador lidar facilmente com os frascos com moscas e soltá-los na ilha(Figura 1A).
3. Prepare uma plataforma elevada de 10 x 15 x 2,5 cm^{de 3} cm de dimensão, feita de um material impermeável (PMMA ou plástico) que seja impermeável.
   NOTA: Esta plataforma é necessária para ter uma superfície branca uniforme para garantir um bom contraste para análise de imagem. O tamanho não é necessariamente fixo, mas deve ser grande o suficiente para garantir que todas as moscas aterrissem inicialmente na plataforma e tenha a chance de andar sobre ela(Figura 1A).
4. Corrija a plataforma colando-a no banho ou colocando pesos ou outros objetos pesados dentro da caixa de plataforma para evitar alterações posicionais da plataforma durante a sessão experimental/de filmagem.

2. Requisitos e Instalação de software

1. Instalação de software de gravação de imagens.
   1. Baixe o software de gravação de imagens para gravar a série de imagens da ilha (veja a Tabela de Materiais) e instale o software em um computador.
      NOTA: O software de gravação de imagens descrito neste protocolo é suportado apenas pelo Windows. Uma alternativa para outros usuários foi adicionada à Tabela de Materiais.

3. Preparação das moscas a serem testadas no ensaio da ilha

1. Coletar moscas encenadas para cada condição experimental sob anestesia de dióxido de carbono frio ou carbono (CO_2),como descrito anteriormente (durante um período de 1 a 2 dias).
   1. Prepare um mínimo de 3 frascos de amostra por condição experimental, cada um contendo aproximadamente 15 moscas encenadas. Só use moscas com asas intactas e que sejam de idade e sexo semelhantes.
      NOTA: Para os experimentos aqui descritos, 5 frascos de amostra contendo 15 moscas machos dos genótipos w^-; Actin-Gal4/+ (controle) e w^-; Actin-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) foram coletados no dia da eclosão, com idade de 4 dias, e foram usados para realizar o ensaio da ilha. RNAi, cepas de controle e o motorista Actin-gal4 foram obtidos de uma fonte comercial (ver a Tabela de Materiais).
2. Deixe as moscas se recuperarem para evitar efeitos dos anestésicos (pelo menos 1 dia ao usar CO₂) antes de testar as moscas coletadas no ensaio da ilha na idade de interesse.

4. Configuração experimental

NOTA: Ver Figura 1B.

1. Adicione água fria com uma pequena quantidade de sabão na bandeja de banho e posicione a plataforma no meio.
   NOTA: O sabão diminui a tensão superficial da água; moscas que tocam a água se afogarão. Isso evita o aumento da quantidade de moscas voando na caixa durante a progressão da sessão experimental.
2. Coloque a caixa transparente em cima da bandeja e ilumine a plataforma de cima usando uma lâmpada.
   NOTA: A iluminação da plataforma é necessária principalmente para garantir o contraste de vídeo adequado. Uma luz LED comum de 12 V é apropriada para isso.
3. Posicione a webcam diretamente acima da plataforma (fora da caixa) e conecte-a a um computador.
4. Crie novas pastas no computador para armazenar os diferentes dados experimentais antes dos experimentos.
   1. Siga a estrutura do exemplo ilustrado na Figura 2A para criar as pastas. Por exemplo, se o design experimental requer testar dois genótipos com cinco réplicas cada, primeiro crie uma pasta principal contendo a data do experimento. Dentro da pasta principal, crie duas subpastas (uma por genótipo). Dentro das pastas do genótipo, crie cinco novas subpastas, uma por réplica.
      NOTA: Para análise mais aprofundada, é essencial que a série de imagens correspondente a experimentos individuais seja salva em pastas com nomes exclusivos.

5. Configuração de configurações de vídeo na seção "Dispositivo de captura" da interface

1. Abra o software de gravação de imagens e, na guia "Capturar", clique em "Imagens de lapso de tempo..." e selecione a webcam apropriada como o "Dispositivo de Captura".
2. Coloque uma mosca morta na ilha; ajuste as configurações de vídeo clicando na caixa "Configurações de vídeo". Role pelas barras de ferramentas, ajustando brilho, contraste e cor de forma que a mosca morta apareça preta em um fundo branco(Figura 2B). Quando os ajustes estiverem concluídos, clique em "Ok".

6. Configuração de configurações de gravação e salvamento de vídeo na seção "Time-lapse" da interface

1. Ajuste as configurações na "Configuração de filme time-lapse" para salvar o experimento como um arquivo .avi. Clique em "Procurar...", selecione o diretório onde o filme será armazenado, defina o nome do vídeo e pressione "salvar".
   NOTA: O arquivo de vídeo não é usado para quantificação de dados; no entanto, pode ser útil ter uma ideia geral sobre o experimento.
2. Ajuste as configurações na seção "Configuração do filme time-lapse".
   1. Na caixa de compactação, selecione "Código Intel IYUV" para compactação de vídeo e escolha "Pegue um quadro a cada 0,1 segundos", com a "taxa de reprodução (imagens por segundo):" às 10.
   2. Salve a série de tempo de experimento como .bmp quadros clicando em "Advanced..." Selecione "Criar uma imagem .bmp para cada quadro capturado". Clique em "Procurar". Selecione o mesmo diretório na janela "Durante a captura de filme AVI" (como escolhido na etapa 6.1), clique em "Abrir" e pressione "Ok".
      NOTA: Observe que, durante o experimento, os quadros são armazenados como .bmp arquivos (necessários para análise de dados). O programa nomeia os quadros como "A" seguidos do número correspondente à sequência de captura de quadros (por exemplo,"A_number.bmp")(Figura 2C). Sempre salve as imagens pertencentes a diferentes experimentos em uma nova pasta para garantir que séries de imagens gravadas anteriormente não sejam substituídas. Esteja ciente de que as imagens não são salvas automaticamente na mesma pasta que o arquivo de vídeo, a menos que esta pasta seja selecionada em "Procurar..." ao clicar na caixa "Avançado".

7. Ensaio de Ilha e Coleta de Dados

1. Pressione o botão iniciar na interface de imagem de lapso de tempo do software de gravação de imagens para iniciar a gravação.
2. Toque no frasco experimental contendo moscas (passo 3) 2-3 vezes para garantir que as moscas estejam na parte inferior do frasco. Remova rapidamente o plugue do frasco e, com um movimento vigoroso, toque no frasco na plataforma para que todas as moscas caiam sobre a plataforma ao mesmo tempo(Figura 1C).
3. Depois de aproximadamente 30 s, pressione o botão "Parar" para parar de gravar.
   NOTA: Se todas as moscas desaparecerem da plataforma, a gravação pode ser interrompida mais cedo.
4. Remova as moscas que permanecem por 30 s na plataforma manualmente depois de parar a gravação da imagem.
5. Antes de prosseguir para a gravação do próximo experimento, altere o diretório de destino para o .bmp arquivos e filmes (ver seção 6).

Representative Results

Figura 1: Fluxograma delineando os requisitos, procedimento experimental e análise do ensaio da ilha. (A) Equipamento de ensaio de ilha. (B) Configuração experimental para o ensaio da ilha. (C)Ensaio da ilha. (D) Processamento de dados de ensaios insulares com a macro "Drosophila Island Assay". A macro"Drosophila Island Assay" é composta por 3 sub-macros: 1) fazer pilha e projeção, 2) definir plataforma e 3) análise. (E) Processamento e avaliação estatística dos dados utilizando o script "Análise de Ensaio de Ilha". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Exemplos de diferentes ajustes necessários durante o protocolo. (A) A estrutura de diretório necessária na qual os experimentos de ensaios insulares devem ser armazenados para processamento e análise de dados. (B) Ao ajustar as configurações de vídeo, as moscas devem aparecer pretas em um fundo branco. (C) Arquivos de saída de quadro de imagem salvos pelo software de gravação de imagens descrito neste manuscrito. (D) O contorno amarelo mostra a seleção da plataforma. A seleção de plataforma armazenada no "ROI Manager" é destacada em azul. (E) As moscas são representadas como pontos brancos durante o ajuste da "configuração mínima do tamanho da mosca". A janela de resultados mostra a área das moscas em pixels. (F) Exemplo de um único quadro de imagem gravado (à esquerda) e o quadro correspondente na pilha de imagem resultante, obtido com a macro "Drosophila Island Assay" (à direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 x 95 mm Drosophila vials	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 HD Webcam	Logitech	-	Any webcam with USB connection is suitable.
Stand to hold webcam	-	-	-
Lamp	-	-	12 V LED lights are appropriate
Pounding pad	-	-	Any mouse pad works
Island Assay box	-	-	Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.
Island Assay bath	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Non white.
Island/platform	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.
Soap	-	-	Standard dishwashing detergent is suitable.
Computer	-	-	Scripts run both on Windows and Mac
Image-recording software: HandiAvi®	AZcendant®	-	HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)
Image-recording software: WebcamCapture	-	-	Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting.