Protocolo de vida útil para Drosophila melanogaster: Generación de curvas de supervivencia para identificar diferencias en la longevidad de moscas

Overview

Los científicos utilizan el protocolo drosophila lifespan para medir cómo diferentes condiciones experimentales afectan la longevidad de las moscas y generan curvas de supervivencia en el proceso para cuantificar los resultados experimentales. El protocolo de muestra presenta el ensayo que se está aplicando para estudiar los efectos sobre la longevidad de la exposición a concentraciones variables de sustancias químicas disruptores endocrinas, o EDC, como 17-α-ethinylestradiol (EE2).

Protocol

Este protocolo es un extracto de Bovier et al., Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).

1. Preparación de alimentos

1. Para el mantenimiento de las poblaciones y para el crecimiento larvario, utilice un medio cornmeal que contenga un 3% de levadura en polvo, 10% sacarosa, 9% harina de maíz precocinada, 0,4% agar, a partir de entonces llamado medio cornmeal (CM).
   1. Poner 30 g de levadura en 100 ml de agua del grifo, llevarlo a ebullición y dejar que hierva durante 15 minutos.
   2. Por separado, mezcle bien 90 g de harina de maíz precocida, 100 g de azúcar y 4 g de agar en 900 ml de agua del grifo.
   3. Lleve la solución a ebullición, baje el fuego y cocine durante 5 minutos revolviendo continuamente.
   4. Después de 5 minutos, agregue la solución de levadura caliente y cocine a fuego lento durante otros 15 minutos.
   5. Apague la fuente de calor y deje que la solución se enfríe a unos 60 °C.
   6. Añadir 5 mL/L de 10% metilo 4-hidroxibenzoato en etanol, mezclar bien y dejar reposar durante 10 min.
      NOTA: Tenga cuidado con la cantidad de metilo 4-hidroxibenzoato, dado que una alta concentración de fungicida podría ser letal para las larvas.
   7. Dispense el medio en viales/botellas: 8 ml en cada vial de mosca (25 mm x 95 mm), 3 ml en cada vial de mosca (22 mm x 63 mm) y 60 ml en cada botella de mosca (250 ml).
   8. Cubra los viales con tela de queso y déjelos secar a temperatura ambiente (RT) durante 24 h antes del almacenamiento.
   9. Calibrar experimentalmente la consistencia correcta y la hidratación de la CM modificando la cantidad de agar utilizado y/o los tiempos de enfriamiento/secado.
      NOTA: Los viales desenchufados, en caja y envueltos son estables durante unos 15 días a 4 °C.
2. Para los adultos de Drosophila, utilice un medio que contenga un 10% de levadura en polvo, 10% sacarosa, 2% agar, a partir de entonces llamado medio adulto (AM).
   1. Mezclar 10 g de levadura en polvo, 10 g de sacarosa, 2 g de agar en 100 ml de agua destilada.
   2. Lleve esta mezcla a ebullición dos veces, con un intervalo de 3 minutos, o hasta que el agar se disuelva, usando un microondas.
   3. Una vez que la solución se enfríe a 60 °C, agregue 5 ml/L de 10% de metil 4-hidroxibenzoato en etanol, mezcle bien y dispense en viales (10 ml por vial).
   4. Cubra los viales con tela de queso y déjelos secar en RT durante 24 h antes de guardarlos.
      NOTA: Los viales desenchufados, en caja y envueltos son estables durante unos 15 días a 4 °C.

2. Dosificación de Drosophila EDC

1. Prepare una solución de stock adecuada que disuelva el EDC seleccionado en el disolvente adecuado. Para el EE2 (peso molecular 296.403), disolver 1.48 g en 10 ml de etanol 100% para hacer una solución de stock de 0.5 M y almacenar a -80 °C.
   PRECAUCIÓN: Los EDC se consideran contaminantes ambientales y deben tomarse precauciones en su manejo.
2. Diluir la solución de stock EE2 en 10% etanol en agua (v/v) con el fin de obtener una solución de 100 mM. Realice las siguientes diluciones (0,1 mM, 0,5 mM y 1 mM) en alimentos cm, comenzando con la concentración más baja y utilizando la misma concentración final de disolvente para cada grupo de tratamiento. Para los viales de control utilizar el mismo volumen del disolvente solo.
   NOTA: se recomienda mantener la concentración final del disolvente lo más baja posible, teniendo en cuenta que la concentración final de etanol no debe exceder el 2% en los alimentos con mosca.
3. Añadir la solución que contiene la dilución correcta de la EDC seleccionada a los alimentos a base de harina de maíz antes de la solidificación, mezclar a fondo con un procesador de alimentos, dispensar 10 ml en viales, cubrir con gasa de algodón y dejar secar en RT durante 16 h antes de usarlo.
   NOTA: utilice este medio inmediatamente después de su preparación.
4. Para la cría de adultos, preparar diferentes soluciones ee2 en funcionamiento (10 mM, 50 mM y 100 mM, respectivamente) en 10% etanol en agua (v/v) y capa 100 μL de cada uno en la superficie del AM, con el fin de obtener la concentración deseada del EE2 (0,1 mM, 0,5 mM y 1 mM). Para el control utilice el mismo volumen del disolvente solo.
   NOTA: alternativamente, añadir la solución que contiene la dilución correcta de la EDC seleccionada a una pequeña cantidad de AM en un tubo cónico de 50 ml, vórtice a fondo y estratificar 1 mL de ella en la superficie de los viales AM.
   1. Cubra los viales con gasa de algodón, deje secar en RT durante 12-16 h bajo una agitación suave y utilícelos inmediatamente.
      NOTA: el proceso de secado debe ajustarse experimentalmente porque depende de la humedad ambiente.

3. Cría de moscas

1. Utilice una cepa isogénica robusta, como Oregon R, mantenida por varias generaciones en el laboratorio.
2. Mantenga las moscas en una incubadora humidificada y controlada por temperatura, con una luz natural de 12 h: 12 h de fotoperiodo oscuro a 25 °C en viales que contengan alimentos CM.
3. En cada ensayo, utilice viales en RT.

4. Protocolo de vida útil

1. Instalar 20 viales de moscas con 8 hembras y 4 machos y casa a 25 °C en CM (10 ml cada uno).
2. Después de 4 días deseche las moscas y coloque los viales de nuevo en la incubadora.
   NOTA: estas moscas se pueden utilizar para comenzar de nuevo para obtener otras cohortes sincronizadas por la edad de las moscas.
3. A última hora de la tarde del día 9, retire todas las moscas recién eclosed de los viales y devuelva los viales a la incubadora.
   NOTA: algunos adultos deben comenzar a eclosionar tan pronto como el noveno día; descartar estas moscas permite recoger un número máximo de moscas sincronizadas, evitando la selección descuidada de los primeros emergentes.
4. 16-24 h más tarde, transferir las moscas adultas (1 día de edad) de ambos sexos en cuatro grupos de botellas de 250 ml que contienen alimentos AM complementados con tres concentraciones diferentes de EDC y uno con el disolvente solo. Si es necesario, recopile otro lote al día siguiente.
5. Mantenga las moscas a 25 °C durante 2-3 días para permitirles aparearse.
   NOTA: el día de transferencia a los viales alimentarios am corresponde al primer día de la edad adulta.
6. Después de dos o tres días, ordene cada cohorte de moscas por sexo en dos grupos bajo anestesia ligera de CO_2. Subdivide aleatoriamente cada sexo en cinco viales por tratamiento a una densidad de 20 individuos por vial, hasta que haya tres réplicas de 5 viales paralelos por cada género por cada tratamiento.
   NOTA: Trabajar con pequeños grupos de moscas con el fin de prevenir posibles problemas de salud duraderos debido a un largo tiempo de exposición al CO_2.
7. Prepare una hoja de cálculo de vida útil en la que se reste el número de moscas muertas del número de moscas sobrevivientes a la transferencia anterior, de tal manera que obtenga automáticamente el número de sobrevivientes en cada transferencia.
8. Transfiera moscas a nuevos viales que contengan los alimentos correspondientes cada 3 días al mismo tiempo y compruebe si hay muerte.
   NOTA: la transferencia debe realizarse sin anestesia que podría tener un efecto negativo a largo plazo en la longevidad de la mosca.
   1. En cada traslado, registre la edad de las moscas y el número de moscas muertas.
      NOTA: el número de moscas supervivientes se calcula automáticamente en la hoja de cálculo, pero se recomienda comprobarlo visualmente. Las moscas que accidentalmente escapan o mueren durante la transferencia no deben ser consideradas. Tenga cuidado de no contar dos veces moscas muertas llevadas al nuevo vial informando de esta nota en la hoja de cálculo.
   2. Repita los pasos 4.8 y 4.8.1 hasta que todas las moscas mueran.
9. Para cada grupo de tratamiento, cree una curva de supervivencia como se muestra en la Figura 1,con el fin de mostrar la probabilidad de supervivencia de una mosca en cualquier momento determinado.
10. Realice tres experimentos independientes para cada grupo de tratamiento de moscas, utilizando 100 moscas recién eclosed para cada experimento.
11. Preparar una tabla en la que informar de la vida media (días medios de supervivencia de todas las moscas para cada grupo), el tiempo medio de muerte (período de tiempo en días requeridos para alcanzar el 50% de mortalidad) y la vida útil máxima (cantidad máxima de días necesarios para alcanzar el 90% de mortalidad).
12. Calcular las diferencias de porcentaje entre cada grupo de tratamiento con respecto al grupo de control.
13. Realizar análisis estadísticos para comparar los diferentes grupos de tratamiento.

Representative Results

Figura 1: Curvas de vida útil. A la izquierda, se informa de una tabla representativa en la que se ha registrado el número de moscas muertas cada 3 días, tanto para el grupo de tratamiento (medio + EDC [0,05 mM EE2]) como para el grupo de control (medio + disolvente), durante todo el período experimental. La vida útil media de cada grupo se ha calculado utilizando matrix sum. PRODUCTO; el grupo tratado acortó la vida media en comparación con el grupo de control. A la derecha, se muestra una curva de supervivencia típica de moscas macho alimentadas con medio que contiene EE2 (0,05 mM) o sólo etanol para el control. La curva de supervivencia disminuyó más rápidamente para las moscas tratadas que para el grupo de control, con un punto de caída de giro anterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
17α-Ethinylestradiol	Sigma	E4876-1G
Agar for Drosophila medium	BIOSIGMA	789148
Cornmeal	CA' BIANCA
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789008	25 mm x 95 mm
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789009	29 mm x 95 mm
Drosophila Vials	Kaltek	187	22 mm x 63 mm
Ethanol	FLUKA	2860
Glass Bottle			250 mL Bottles
Glass Vials	Microtech	ST 10024	Flat bottom tube 100 x 24
Instant Success yeast	ESKA		Powdered yeast
Methyl4-hydroxybenzoate	SIGMA	H5501
Stereomicroscope with LED lights	Leica		S4E
Sucrose	HIMEDIA	MB025
Hand blender Pimmy	Ariete		food processor