Livslängdsprotokoll för Drosophila melanogaster:Generera överlevnadskurvor för att identifiera skillnader i fluglivslängd

Overview

Forskare använder Drosophilas livslängdsprotokoll för att mäta hur olika experimentella tillstånd påverkar flugornas livslängd och genererar överlevnadskurvor i processen för att kvantifiera de experimentella resultaten. Provprotokollet innehåller den analys som tillämpas för att studera effekterna på livslängden från exponering för olika koncentrationer av hormonstörande kemikalier, eller HORMONStörande ämnen, såsom 17-α-ethinylestradiol (EE2).

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Bovier et al., Metoder för att testa endokrina störningar i Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).

1. Matlagning

1. För lagerunderhåll och larvtillväxt, använd ett majsmjölsmedium som innehåller 3% pulveriserad jäst, 10% sackaros, 9% förkokt majsmjöl, 0,4% agar, därefter kallat Cornmeal medium (CM).
   1. Lägg 30 g jäst i 100 ml kranvatten, koka upp det och låt det koka i 15 minuter.
   2. Blanda separat väl 90 g förkokt majsmjöl, 100 g socker och 4 g agar i 900 ml kranvatten.
   3. Koka upp lösningen, sänk värmen och koka i 5 minuter under omrörning kontinuerligt.
   4. Efter 5 minuter tillsätt den heta jästlösningen och låt sjuda i ytterligare 15 minuter.
   5. Stäng av värmekällan och låt lösningen svalna till ca 60 °C.
   6. Tillsätt 5 ml/L av 10% metyl 4-hydroxibensoat i etanol, blanda noggrant och låt det sitta i 10 min.
      OBS: Var försiktig med mängden metyl 4-hydroxibensoat, med tanke på att en hög koncentration av fungicid kan vara dödlig för larver.
   7. Dela ut mediet i injektionsflaskor/flaskor: 8 ml i varje flygflaska (25 mm x 95 mm), 3 ml i varje flygflaska (22 mm x 63 mm) och 60 ml i varje flugflaska (250 ml).
   8. Täck injektionsflaskan med ostduk och låt dem torka i rumstemperatur (RT) i 24 timmar före förvaring.
   9. Kalibrera den experimentellt rätta konsistensen och hydreringen av CM genom att ändra antingen mängden agar som används och/eller kyl-/torktiderna.
      OBS: Urkopplade, boxade och inslagna injektionsflaskar är stabila i ca 15 dagar vid 4 °C.
2. För drosophila vuxna, använd ett medium som innehåller 10% pulveriserad jäst, 10% sackaros, 2% agar, därefter kallat vuxen medium (AM).
   1. Blanda 10 g pulveriserad jäst, 10 g sackaros, 2 g agar i 100 ml destillerat vatten.
   2. Koka upp blandningen två gånger, med 3 minuters intervall, eller tills agar är upplöst, med hjälp av en mikrovågsugn.
   3. När lösningen svalnat till 60 °C, tillsätt 5 ml/L metyl 4-hydroxibensoat i etanol, blanda noggrant och dispensera i injektionsflaska (10 ml per injektionsflaska).
   4. Täck injektionsflaskan med ostduk och låt dem torka på RT i 24 timmar innan de förvaras.
      OBS: Urkopplade, boxade och inslagna injektionsflaskar är stabila i ca 15 dagar vid 4 °C.

2. Drosophila EDC-dosering

1. Förbered en lämplig stamlösning som löser upp den valda EDC i lämpligt lösningsmedel. För EE2 (molekylvikt 296,403), lös upp 1,48 g i 10 ml 100% etanol för att göra en 0,5 M lagerlösning och lagra vid -80 °C.
   VARNING: EDC betraktas som miljöföroreningar och försiktighetsåtgärder bör vidtas vid hanteringen av dem.
2. Späd EE2-stamlösningen i 10% etanol i vatten (v/v) för att få en 100 mM lösning. Gör nästa utspädningar (0,1 mM, 0,5 mM och 1 mM) i CM-livsmedel, börja med lägsta koncentration och använd samma slutliga koncentration av lösningsmedel för varje behandlingsgrupp. För kontrollflaskan använd enbart samma volym av lösningsmedlet.
   OBS: Det rekommenderas att behålla den slutliga koncentrationen av lösningsmedlet så låg som möjligt, med tanke på att den slutliga koncentrationen av etanol inte bör överstiga 2% i flugmat.
3. Tillsätt lösningen som innehåller rätt utspädning av den valda EDC till den majsmjölsbaserade maten före stelning, blanda noggrant med en matberedare, dispensera 10 ml i injektionsflaskan, täck med bomullsgas och låt torka vid RT i 16 timmar innan du använder den.
   OBS: Använd detta medium omedelbart efter beredningen.
4. För vuxenuppfödning, förbered olika fungerande EE2-lösningar (10 mM, 50 mM respektive 100 mM) i 10% etanol i vatten (v/v) och skikt 100 μL vardera på am-ytan, för att erhålla önskad koncentration av EE2 (0,1 mM, 0,5 mM och 1 mM). För kontroll använd samma volym av lösningsmedlet ensamt.
   OBS: Alternativt, tillsätt lösningen som innehåller rätt utspädning av den valda EDC till en liten mängd AM i ett 50 ml koniskt rör, virveln noggrant och stratifiera 1 ml av den på ytan av AM-injektionsflaskan.
   1. Täck injektionsflaskan med bomullsgas, låt torka vid RT i 12-16 timmar under mild omrörning och använd dem omedelbart.
      OBS: Torkprocessen bör justeras experimentellt eftersom den beror på luftfuktigheten i omgivningen.

3. Uppfödning av flugor

1. Använd en robust isogen stam, såsom Oregon R, som upprätthålls av flera generationer i laboratoriet.
2. Håll flugor i en fuktad, temperaturstyrd inkubator, med ett naturligt 12 h ljus: 12 h mörk fotoperiod vid 25 °C i injektionsflaska som innehåller CM-mat.
3. Använd injektionsflaskan på RT i varje analys.

4. Protokollet om livslängd

1. Ställ in 20 flaskor flugor med 8 honor och 4 hanar och hus vid 25 °C i CM (10 ml vardera).
2. Efter 4 dagar kassera flugor och placera injektionsflaskan tillbaka i inkubatorn.
   OBS: Dessa flugor kan användas för att börja om för att få andra ålderssynkronerade kohorter av flugorna.
3. På sen eftermiddag på dag 9, ta bort alla nyligen eclosed flugor från injektionsflaskan och returnera injektionsflaskan till inkubatorn.
   OBS: några vuxna bör börja eclose så tidigt som den nionde dagen; kassera dessa flugor gör det möjligt att samla ett maximalt antal synkroniserade flugor, vilket undviker det vårdslösa urvalet av tidiga framväxande.
4. 16-24 timmar senare, överför de vuxna flugorna (1 dag gamla) av båda könen till fyra grupper av 250 ml flaskor som innehåller AM-mat kompletterad med tre olika EDC-koncentrationer och en med lösningsmedlet ensamt. Om det behövs, samla in en annan sats nästa dag.
5. Håll flugor vid 25 °C i 2-3 dagar så att de kan kompisera.
   OBS: överföringsdagen till AM matflaska motsvarar den första dagen i vuxen ålder.
6. Efter två-tre dagar sorterar du varje kohort av flugor efter kön i två grupper under lätt CO_{2-bedövning.} Slumpmässigt dela upp varje kön i fem injektionsflaska per behandling med en densitet på 20 individer per injektionsflaska, tills det finns tre replikat av 5 parallella injektionsflaskar för varje kön per behandling.
   OBS: Arbeta med små grupper av flugor för att förhindra eventuella långvariga hälsoproblem på grund av lång exponeringstid för CO₂.
7. Förbered ett livslängdskalkylark där antalet döda flugor subtraheras från antalet överlevande flugor till den tidigare överföringen, på ett sådant sätt att antalet överlevande automatiskt erhålls vid varje överföring.
8. Överföring flyger till nya injektionsflaskar som innehåller motsvarande mat var tredje dag samtidigt och kontrollera om det finns död.
   OBS: överföringen måste ske utan anestesi som kan ha en långsiktig negativ effekt på flugens livslängd.
   1. Vid varje överföring, registrera flugornas ålder och antalet döda flugor.
      OBS: Antalet överlevande flugor beräknas automatiskt i kalkylbladet men det rekommenderas att kontrollera det visuellt. Flugor som oavsiktligt både flyr eller dör under överföringen bör inte övervägas. Var noga med att inte räkna två döda flugor som bärs till den nya flaskan som rapporterar denna anteckning i kalkylbladet.
   2. Upprepa steg 4.8 och 4.8.1 tills alla flugor dör.
9. För varje behandlingsgrupp skapar du en överlevnadskurva som visas i figur 1för att visa överlevnadssannolikheten hos en fluga vid en viss tidpunkt.
10. Utför tre oberoende experiment för varje behandlingsgrupp av flugor, genom att använda 100 nyligen eclosed flugor för varje experiment.
11. Förbered en tabell där du kan rapportera medellivslängden (genomsnittliga överlevnadsdagar för alla flugor för varje grupp), halvdödstiden (tidsperioden i dagar som krävs för att nå 50% dödlighet) och den maximala livslängden (maximal mängd dagar som behövs för att nå 90% dödlighet).
12. Beräkna skillnaderna i procent mellan varje behandlingsgrupp med avseende på kontrollgruppen.
13. Utför statistisk analys för att jämföra de olika behandlingsgrupperna.

Representative Results

Figur 1: Livslängdskurvor. Till vänster rapporteras en representativ tabell där antalet döda flugor har registrerats var tredje dag, både för behandlingsgruppen (medium + EDC [0,05 mM EE2]) och för kontrollgruppen (medium + lösningsmedel), under hela försöksperioden. Medellivslängden för varje grupp har beräknats med hjälp av MATRIX SUM. PRODUKT; den behandlade gruppen förkortade medellivslängden jämfört med kontrollgruppen. Till höger visas en typisk överlevnadskurva av hanflugor som matas med mediuminnehållande EE2 (0,05 mM) eller endast etanol för kontrollen. Överlevnadskurvan minskade snabbare för behandlade flugor än för kontrollgruppen, med en tidigare vändpunkt. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
17α-Ethinylestradiol	Sigma	E4876-1G
Agar for Drosophila medium	BIOSIGMA	789148
Cornmeal	CA' BIANCA
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789008	25 mm x 95 mm
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789009	29 mm x 95 mm
Drosophila Vials	Kaltek	187	22 mm x 63 mm
Ethanol	FLUKA	2860
Glass Bottle			250 mL Bottles
Glass Vials	Microtech	ST 10024	Flat bottom tube 100 x 24
Instant Success yeast	ESKA		Powdered yeast
Methyl4-hydroxybenzoate	SIGMA	H5501
Stereomicroscope with LED lights	Leica		S4E
Sucrose	HIMEDIA	MB025
Hand blender Pimmy	Ariete		food processor