Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

הרכבה של מוחות דרוזופילה למבוגרים: שיטה להכנת שקופיות להדמיה קונפוקלית

Overview

סרטון זה מתאר שיטה להרכבת מוחות שלמים מזבובים בוגרים מתחת למגלשת גשר ומראה את הפרוטוקול המבוצע על מוחות חיסוניים למיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Kelly et al., ניתוק וכתמים אימונופלואורסצנטיים של גוף פטריות ונוירונים פוטורצפטורים במוחות מלנוגסטר דרוזופילה למבוגרים, J. Vis. Exp. (2017).

1. הרכבה למבוגרים D. melanogaster מוחות על שקופיות מיקרוסקופ הדמיה

  1. בנה שקופית "גשר". מקם שני כיסויי "בסיס" במרחק של כ- 1 ס"מ זה מזה בשקופית טעונה חיובית. ודא שהצד הטעון באופן חיובי של השקופית פונה כלפי מעלה. הדבק את הכיסויים לשקופית עם לק ציפורניים כפי שמוצג באיור 1A. זה בדרך כלל מועיל לאטום את שלושת הקצוות החיצוניים של כל כיסוי בסיס להחליק עם לק ציפורן כדי להבטיח מדיה הרכבה לא פתיל תחת אלה כיסוי הבסיס מחליק. תן לק ציפורניים יבש לחלוטין (10 - 15 דקות) לפני שתמשיך.
  2. מקם את השקופית מתחת לסטריאומיקרוסקופ ו pipette פתרון המדיה הרכבה המכיל את המוח מנותח לתוך הרווח בין שני coverslips. כדי לספק ניגודיות רבה יותר, כדאי לתמרן את אורות gooseneck כך שהם מקבילים עם הספסל העליון.
  3. הסר מדיית הרכבה נוספת מהשקופית באמצעות פיפטה, תוך הקפדה שלא להסיר את המוח מהשקופית.
  4. וויק משם מדיה הרכבה נוספת. זה יאפשר למוח להיות ממוקם באופן מדויק יותר במהלך השלב הבא.
  5. באמצעות זוג מלקחיים ואת stereomicroscope, למקם את המוח על השקופית בתבנית רשת עם אונות אנטנה פונה כלפי מעלה.
  6. הניחו תלוש כיסוי ("הגשר") מעל המוח (איור 1A). השתמש לק ציפורניים כדי לאטום את הצדדים של כיסוי הגשר להחליק שבו הם יוצרים קשר עם "בסיס" כיסוי תלושים.
  7. באמצעות פיפטה p200, מלאו באיטיות את החלל המרכזי שמתחת לגשר במדיית הרכבה טרייה (איור 1B). מניחים טיפה אחת בכל פעם על הקצה הפתוח של החלקה המרכזית ומאפשרים למדיית ההרכבה לפתיל מתחת לכיסוי הגשר המרכזי. ממשיכים עד שכל החלל מתמלא במדיית הרכבה, ואז אוטמים את החלק העליון והתחתון בלק ציפורניים שקוף.
  8. לאחר ליטוש הציפורן יבש, תמונה את השקופיות מיד או לאחסן בתיבת שקופית הדוקה עמידה באור ב -20 °C (69 °F).
  9. בתוך שבוע, מוחות תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל סריקת לייזר עם לייזרים עירור וקוביות מסנן המתאימים נוגדנים משניים פלואורסצנטיים שנבחרו. תמונות מחסנית Z של נוירונים גוף פטריות מתקבלים בדרך כלל באמצעות מטרות 20X או 40X. הדמיה של נוירונים פוטורצפטורים ברשתית עשויה לדרוש הגדלה גבוהה יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 1
איור 1: הרכבה של מוחות כהכנה להדמיית כשל חיסוני. (A)מוחות מותקנים על שקופיות SuperFrost Plus עם כיסוי גשר כדי למנוע שיטוח של המוח. שתי תגיות כיסוי "בסיס" דבקות שקופית Superfrost פלוס טעון חיובית עם לק ציפורניים ברור מוחות מנותחים ממוקמים לאחר מכן על השקופית ביניהם. תלוש כיסוי "גשר" ברור ממוקם מעל המוח ודבק בכיסוי הבסיס. (B) לאחר ליטוש הציפורן התייבש, Vectashield הוא צינור לאט מתחת לגשר כדי לשמר את הפלואורסצנטיות של הנוגדן המשני. לאחר מכן נעשה שימוש בלק ציפורניים ברור כדי לאטום את החלק העליון והתחתון של פתק הכיסוי "הגשר". לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microdissection forceps/tweezers Ted Pella 505-NM
VectaShield Vector Labs H-1000
SuperFrost Plus Slides ThermoFisher 99-910-01
Coverslips ThermoFisher 12-553-454
fingernail polish Electron Microscope Services (EMS) 72180
stereomicroscope Leica S6D with KL300 LED light source
Kimwipe Fisher 06-666

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Tags

ערך ריק הנפקה
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter