Монтаж взрослых мозга дрозофилы: метод подготовки слайдов для конфокальной визуализации

Overview

Это видео описывает метод монтажа неповрежденных мозгов взрослых мух под слайдом моста и показывает протокол, выполненный на иммунотлорированных мозгах для флуоресцентной микроскопии.

Protocol

Этот протокол является выдержка из Келли и др.,вскрытие и иммунофлуоресцентное окрашивание грибного тела и фоторецептор нейронов во взрослых drosophila меланогастер мозга, J. Vis. Exp. (2017).

1. Монтаж взрослых D. меланогастер мозги на микроскоп слайды и изображения

1. Постройте слайд "мост". Позиция двух "базовых" крышки примерно на 1 см друг от друга на положительно заряженной слайд. Убедитесь, что положительно заряженная сторона слайда обращена вверх. Придерживайтесь крышки на слайде с лаком для ногтей, как показано на рисунке 1A. Это, как правило, полезно, чтобы запечатать три внешних края каждой базовой крышки скольжения с ногтем польский для обеспечения монтажа средств массовой информации не фитиль под этими листами базовой крышки. Пусть ногти полировать сухой полностью (10 - 15 мин) до начала.
2. Поместите слайд под стереомикроскоп и пипетку монтажный медиа-раствор, содержащий расчлененные мозги, в пространство между двумя крышками. Чтобы обеспечить больше контраста, полезно маневрировать гусиными огнями так, чтобы они были параллельны верхней скамейке.
3. Удалите дополнительные монтажные средства со слайда с помощью пипетки, будьте осторожны, чтобы не пипетки мозги со слайда.
4. Wick от дополнительных монтажных средств массовой информации. Это позволит мозгу быть расположены более точно во время следующего шага.
5. Используя пару типсов и стереомикроскоп, распоить мозг на слайде в сетке шаблон с антенными долями вверх.
6. Поместите крышку скольжения ("мост") над мозгами(рисунок 1А). Используйте лак для ногтей, чтобы запечатать стороны крышки моста скольжения, где они контактируют с "базы" крышка скользит.
7. Используя р200 пипетку, медленно заполните центральную полость под мостом свежим монтажом мультимедиа(рисунок 1B). Поместите одну каплю в то время, на открытом краю центра coverslip и позволяют монтажа средств к фитиль под центральным мостом coverslip. Продолжайте до тех пор, пока вся полость не будет заполнена монтажными средствами, затем запечатав верхнюю и нижнюю части четким лаком для ногтей.
8. После того, как лак для ногтей высохнет, изображение слайдов немедленно или хранить в светонепроницаемой жесткой слайд-бокс при -20 градусов по Цельсию.
9. В течение одной недели, изображение мозга с помощью лазерного сканирования конфокального микроскопа с возбуждением лазеров и фильтр кубов подходит для выбранных флуоресцентных вторичных антител. Изображения нейронов грибного тела, как правило, получены с помощью целей 20X или 40X. Изображение нейронов фоторецептора сетчатки может потребовать более высокого увеличения.

Representative Results

Рисунок 1: Монтаж мозга в рамках подготовки к иммунофлуоресценции изображения. (A)Мозги устанавливаются на слайдах SuperFrost Plus с крышкой моста, чтобы предотвратить уплощение мозга. Два "базовых" крышки скользит придерживаются Superfrost Plus положительно заряженный слайд с четким лаком ногтя и расчлененные мозги затем помещаются на слайде между ними. Четкое "мост" крышка скольжения помещается над мозгами и придерживается базовой крышки скользит. (B)После того, как лак для ногтей высохнет, Vectashield медленно трубы под мостом, чтобы сохранить флуоресценцию вторичного антитела. Чистый лак для ногтей затем используется для уплотнения верхней и нижней части "моста" крышка скольжения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
VectaShield	Vector Labs	H-1000
SuperFrost Plus Slides	ThermoFisher	99-910-01
Coverslips	ThermoFisher	12-553-454
fingernail polish	Electron Microscope Services (EMS)	72180
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
Kimwipe	Fisher	06-666