Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

تصاعد الكبار Drosophila العقول : طريقة لإعداد الشرائح للتصوير Confocal

Overview

يصف هذا الفيديو طريقة لتركيب الأدمغة السليمة من الذباب البالغ تحت شريحة جسر ويظهر البروتوكول الذي تم إجراؤه على الأدمغة الملطخة بالمناعة للفحص المجهري الفلوري.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من كيلي وآخرون., تشريح وتلطيخ Immunofluorescent من الجسم الفطر والخلايا العصبية مستقبلات ضوئية في الكبار Drosophila melanogaster العقول, J. Vis. Exp. (2017).

1. تصاعد الكبار D. melanogaster العقول على الشرائح المجهر والتصوير

  1. إنشاء شريحة "جسر". موقف اثنين من "قاعدة" coverslips ما يقرب من 1 سم عن بعضها البعض على شريحة مشحونة إيجابيا. تأكد من مواجهة الجانب المشحون إيجابيا من الشريحة لأعلى. الالتزام coverslips إلى الشريحة مع طلاء الأظافر كما هو مبين في الشكل 1A. ومن المفيد عادة لختم الحواف الخارجية الثلاثة من كل غطاء قاعدة زلة مع طلاء الأظافر لضمان تصاعد وسائل الإعلام لا الفتيل تحت هذه زلات غطاء قاعدة. دع تلميع الأظافر يجف تماما (10 - 15 دقيقة) قبل المتابعة.
  2. ضع الشريحة تحت المجسم وماصة حل الوسائط المتصاعدة التي تحتوي على الأدمغة تشريح في الفضاء بين اثنين من coverlips. لتوفير المزيد من التباين، فمن المفيد للمناورة أضواء gooseneck بحيث تكون موازية مع أعلى مقاعد البدلاء.
  3. إزالة وسائل الإعلام تصاعد اضافية من الشريحة باستخدام ماصة، مع الحرص على عدم ماصة العقول قبالة الشريحة.
  4. ويك بعيدا وسائل الإعلام تصاعد اضافية. وهذا سيسمح للأدمغة أن تكون في وضع أكثر دقة خلال الخطوة التالية.
  5. باستخدام زوج من ملقط ومجسم، وضع العقول على الشريحة في نمط الشبكة مع فصوص هوائية تواجه ما يصل.
  6. ضع زلة غطاء ("الجسر") فوق الأدمغة(الشكل 1A). استخدام طلاء الأظافر لختم الجانبين من زلة غطاء الجسر حيث يتصلون "قاعدة" زلات الغطاء.
  7. باستخدام ماصة P200، ملء ببطء تجويف مركز تحت الجسر مع وسائل الإعلام تصاعد جديدة (الشكل 1B). وضع قطرة واحدة في وقت واحد على الحافة المفتوحة للأغطية مركز والسماح للوسائط المتصاعدة إلى الفتيل تحت غطاء الجسر المركزي. استمر حتى يمتلئ التجويف بأكمله بالوسائط المتصاعدة، ثم قم بختم الجزء العلوي والسفلي بتلميع الأظافر الواضح.
  8. بمجرد جفاف طلاء الأظافر، قم بتصوير الشرائح على الفور أو تخزينها في صندوق شرائح ضيق مقاوم للضوء عند -20 درجة مئوية.
  9. في غضون أسبوع واحد ، صورة العقول باستخدام المجهر confocal الليزر المسح الضوئي مع أشعة الليزر الإثارة ومكعبات التصفية المناسبة للأجسام المضادة الثانوية الفلورسنت المختار. عادة ما يتم الحصول على صور Z-كومة من الخلايا العصبية الجسم الفطر باستخدام أهداف 20X أو 40X. قد يتطلب تصوير الخلايا العصبية مستقبلات ضوئية الشبكية زيادة التكبير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 1
الشكل 1: تصاعد العقول استعدادا للتصوير immunofluorescence. (أ)يتم تركيب الأدمغة على شرائح SuperFrost Plus مع غطاء جسر لمنع تسطيح الأدمغة. يتم الالتزام بزلتين من الغطاء "الأساسي" إلى شريحة Superfrost Plus المشحونة بشكل إيجابي مع طلاء الأظافر الواضح ثم يتم وضع الأدمغة المفرغة على الشريحة بينهما. يتم وضع زلة غطاء "جسر" واضحة فوق العقول والالتزام زلات الغطاء الأساسي. (ب)مرة واحدة وقد جفت طلاء الأظافر، يتم أنبوب Vectashield ببطء تحت الجسر للحفاظ على مضان الأجسام المضادة الثانوية. ثم يتم استخدام طلاء الأظافر واضحة لختم الجزء العلوي والسفلي من "جسر" زلة الغطاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microdissection forceps/tweezers Ted Pella 505-NM
VectaShield Vector Labs H-1000
SuperFrost Plus Slides ThermoFisher 99-910-01
Coverslips ThermoFisher 12-553-454
fingernail polish Electron Microscope Services (EMS) 72180
stereomicroscope Leica S6D with KL300 LED light source
Kimwipe Fisher 06-666

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Tags

قيمة فارغة، مشكلة ،
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter