Montagem de cérebros de drosophila adultos: um método para preparar slides para imagens confocal

Overview

Este vídeo descreve um método de montagem de cérebros intactos de moscas adultas sob um escorregador de ponte e mostra o protocolo realizado em cérebros imunossundo para microscopia fluorescente.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Kelly et al., Dissecção e Coloração Imunofluorescente de Corpo de Cogumelo e Neurônios Fotorreceptores em Cérebros melanogaster drosophila adulto, J. Vis. Exp. (2017).

1. Montagem cérebros adultos D. melanogaster em slides e imagens de microscópio

1. Construa um slide de "ponte". Posicione duas tampas "base" de aproximadamente 1 cm de distância em um slide carregado positivamente. Certifique-se de que o lado carregado positivamente do slide está voltado para cima. Adere as tampas ao slide com polimento de unha, como mostrado na Figura 1A. Geralmente é útil selar as três bordas externas de cada deslizamento de cobertura base com polimento de unhas para garantir que a mídia de montagem não se adere sob esses deslizamentos de cobertura base. Deixe a unha polir completamente (10 - 15 min) antes de prosseguir.
2. Coloque o slide sob o estereótipo e pipeta a solução de mídia de montagem contendo os cérebros dissecados no espaço entre as duas tampas. Para proporcionar mais contraste, é útil manobrar as luzes de ganso para que elas estejam paralelas com a parte superior do banco.
3. Remova a mídia de montagem extra do slide usando uma pipeta, tomando cuidado para não pipetar os cérebros da lâmina.
4. Wick longe mídia extra de montagem. Isso permitirá que os cérebros sejam posicionados com mais precisão durante o próximo passo.
5. Usando um par de fórceps e o estereótipo, posicione os cérebros na lâmina em um padrão de grade com lóbulos antenas voltados para cima.
6. Coloque um deslizamento de cobertura (a "ponte") sobre o cérebro(Figura 1A). Use polimento de unhas para selar as laterais da tampa da ponte onde eles entram em contato com os deslizamentos de cobertura "base".
7. Usando uma pipeta p200, encha lentamente a cavidade central sob a ponte com mídia de montagem fresca(Figura 1B). Coloque uma gota de cada vez na borda aberta da tampa central e permita que a mídia de montagem se ateesse sob a tampa da ponte central. Continue até que toda a cavidade esteja cheia de mídia de montagem, em seguida, sele a parte superior e inferior com polimento de unha clara.
8. Uma vez que o polimento da unha esteja seco, imagem os slides imediatamente ou armazenar em uma caixa de slides apertada à prova de luz a -20 °C.
9. Dentro de uma semana, cérebros de imagem usando um microscópio confocal de varredura a laser com lasers de excitação e cubos de filtro apropriados para os anticorpos secundários fluorescentes escolhidos. Imagens de pilha de z de neurônios corporais de cogumelos são tipicamente obtidas usando objetivos 20X ou 40X. A imagem dos neurônios do fotorreceptor da retina pode exigir maior ampliação.

Representative Results

Figura 1: Montagem de cérebros em preparação para a imagem de imunofluorescência. (A) Os cérebros são montados em slides SuperFrost Plus com uma tampa de ponte para evitar o achatamento dos cérebros. Dois deslizamentos de cobertura "base" são aderidos a um slide Superfrost Plus carregado positivamente com polimento de unhas claras e cérebros dissecados são então colocados no slide entre eles. Um deslizamento de cobertura "ponte" clara é colocado acima do cérebro e aderido aos deslizamentos de cobertura base. (B) Uma vez que o polimento da unha secou, Vectashield é lentamente esbofetado sob a ponte para preservar a fluorescência do anticorpo secundário. O polimento das unhas claras é então usado para selar a parte superior e inferior do deslizamento de cobertura "ponte". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
VectaShield	Vector Labs	H-1000
SuperFrost Plus Slides	ThermoFisher	99-910-01
Coverslips	ThermoFisher	12-553-454
fingernail polish	Electron Microscope Services (EMS)	72180
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
Kimwipe	Fisher	06-666