Montering av voksne Drosophila-hjerner: En metode for å forberede lysbilder for konfokal avbildning

Overview

Denne videoen beskriver en metode for montering av intakte hjerner fra voksne fluer under en brosklie og viser protokollen som utføres på immunosterte hjerner for fluorescerende mikroskopi.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Kelly et al.,Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017).

1. Montering av voksne D. melanogasterhjerner på mikroskopsklier og bildebehandling

1. Bygg et "bro"-lysbilde. Plasser to "base"-deksler omtrent 1 cm fra hverandre på et positivt ladet lysbilde. Kontroller at den positivt ladede siden av lysbildet vender opp. Fest dekslene til lysbildet med neglelakk som vist i figur 1A. Det er vanligvis nyttig å forsegle de tre ytre kantene på hvert basedeksel med neglelakk for å sikre at monteringsmediene ikke transporterer under disse basedekselskliene. La neglelakken tørke helt (10 - 15 min) før du fortsetter.
2. Plasser gliden under stereomikroskopet og pipette monteringsmedieløsningen som inneholder de dissekerte hjernene i rommet mellom de to dekslene. For å gi mer kontrast er det nyttig å manøvrere gooseneck-lysene slik at de er parallelle med benkeplaten.
3. Fjern ekstra monteringsmedier fra lysbildet ved hjelp av en pipette, og vær forsiktig så du ikke pipetter hjernen av lysbildet.
4. Fjern ekstra monteringsmedier. Dette vil tillate hjernen å bli plassert mer presist i løpet av neste trinn.
5. Bruk et par tang og stereomikroskopet, plasser hjernene på lysbildet i et rutenettmønster med antennelober vendt opp.
6. Plasser en dekselslipp ("broen") over hjernen (Figur 1A). Bruk neglelakk til å forsegle sidene på brodekselslippet der de kommer i kontakt med "base"-dekselet.
7. Bruk en p200-pipette til å fylle midthulen under broen langsomt med ferske monteringsmedier (Figur 1B). Plasser en dråpe om gangen på den åpne kanten av senterdekslene og la monteringsmediet veke under senterbrodekslene. Fortsett til hele hulrommet er fylt med monteringsmedier, og forsegle deretter toppen og bunnen med klar neglelakk.
8. Når neglelakken er tørr, kan du se på lysbildene umiddelbart eller oppbevare dem i en lystett, tett glideboks ved -20 °C.
9. Innen en uke, bildehjerner ved hjelp av en laser-skanning konfokal mikroskop med eksitasjon lasere og filter kuber som passer til de valgte fluorescerende sekundære antistoffer. Z-stack bilder av sopp kroppen nevroner er vanligvis oppnådd ved hjelp av 20X eller 40X mål. Avbildning av retinal fotoreseptor nevroner kan kreve høyere forstørrelse.

Representative Results

Figur 1: Montering av hjerner som forberedelse til immunfluorescensavbildning. (A) Hjerner er montert på SuperFrost Plus lysbilder med et brodeksel for å forhindre sammenslåing av hjernen. To "base" cover slips er festet til en Superfrost Plus positivt ladet lysbilde med klar neglelakk og dissekerte hjerner blir deretter plassert på lysbildet mellom dem. En klar "bro" dekkslipp er plassert over hjernen og festet til grunndekselskliene. (B) Når neglelakken er tørket, pipetteres Vectashield sakte under broen for å bevare fluorescensen til det sekundære antistoffet. Klar neglelakk brukes deretter til å forsegle toppen og bunnen av "bridge" dekselslippet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
VectaShield	Vector Labs	H-1000
SuperFrost Plus Slides	ThermoFisher	99-910-01
Coverslips	ThermoFisher	12-553-454
fingernail polish	Electron Microscope Services (EMS)	72180
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
Kimwipe	Fisher	06-666