Montage des cerveaux de drosophile adulte : une méthode pour préparer des diapositives pour l’imagerie confocale

Overview

Cette vidéo décrit une méthode de montage des cerveaux intacts des mouches adultes sous une glissade de pont et montre le protocole effectué sur les cerveaux immunosurchés pour la microscopie fluorescente.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Kelly et coll.,Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017).

1. Montage des cerveaux adultes D. melanogaster sur les diapositives et l’imagerie au microscope

1. Construisez une diapositive « pont ». Placez deux couvertures « de base » à environ 1 cm l’une de l’autre sur une glissière chargée positivement. Assurez-vous que le côté chargé positivement de la glissière est orienté vers le haut. Adhérez les coverslips à la diapositive avec du vernis à ongles comme le montre la figure 1A. Il est généralement utile de sceller les trois bords extérieurs de chaque glissement de couverture de base avec du vernis à ongles pour s’assurer que les supports de montage ne se mèchent pas sous ces glissements de couverture de base. Laisser sécher complètement le vernis à ongles (10 à 15 min) avant de procéder.
2. Placez la diapositive sous le stéréomicroscope et pipette la solution de support de montage contenant les cerveaux disséqués dans l’espace entre les deux coverslips. Pour fournir plus de contraste, il est utile de manœuvrer les lumières gooseneck de sorte qu’ils soient parallèles avec le dessus du banc.
3. Retirez les supports de montage supplémentaires de la lame à l’aide d’une pipette, en prenant soin de ne pas pipette les cerveaux de la diapositive.
4. Wick loin des médias de montage supplémentaires. Cela permettra aux cerveaux d’être positionnés plus précisément au cours de la prochaine étape.
5. À l’aide d’une paire de forceps et du stéréomicroscope, placez le cerveau sur la glissière dans un motif de grille avec des lobes d’antenne orientés vers le haut.
6. Placez un glissement de couverture (le « pont ») sur le cerveau (figure 1A). Utilisez du vernis à ongles pour sceller les côtés du glissement du couvercle du pont lorsqu’ils communiquent avec les feuillets de couverture « de base ».
7. À l’aide d’une pipette p200, remplissez lentement la cavité centrale sous le pont avec des supports de montage frais (figure 1B). Placez une goutte à la fois sur le bord ouvert de la couverture centrale et permettre aux supports de montage de mèche sous le couvre-pont central. Continuer jusqu’à ce que toute la cavité soit remplie de supports de montage, puis sceller le haut et le bas avec du vernis à ongles clair.
8. Une fois que le vernis à ongles est sec, imagez les glissières immédiatement ou rangez-les dans une boîte à glissière étanche à l’épreuve de la lumière à -20 °C.
9. En moins d’une semaine, les cerveaux d’image utilisant un microscope confocal laser-balayage avec des lasers d’excitation et des cubes de filtre appropriés aux anticorps secondaires fluorescents choisis. Les images z-stack des neurones corporels des champignons sont généralement obtenues à l’aide d’objectifs 20X ou 40X. L’imagerie des neurones photorécepteurs rétiniens peut nécessiter un grossissement plus élevé.

Representative Results

Figure 1 : Montage du cerveau en préparation de l’imagerie par immunofluorescence. (A) Les cerveaux sont montés sur des glissières SuperFrost Plus avec un couvercle de pont pour empêcher l’aplatissement du cerveau. Deux feuillets de couverture « de base » sont adhérés à une glissière chargée positivement superfrost Plus avec du vernis à ongles clair et des cerveaux disséqués sont ensuite placés sur la glissière entre eux. Un glissement clair de couverture de « pont » est placé au-dessus du cerveau et adhéré aux glissements de couverture de base. (B) Une fois que le vernis à ongles a séché, Vectashield est lentement pipetted sous le pont pour préserver la fluorescence de l’anticorps secondaire. Le vernis à ongles clair est ensuite utilisé pour sceller le haut et le bas du glissement de couverture « pont ». S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
VectaShield	Vector Labs	H-1000
SuperFrost Plus Slides	ThermoFisher	99-910-01
Coverslips	ThermoFisher	12-553-454
fingernail polish	Electron Microscope Services (EMS)	72180
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
Kimwipe	Fisher	06-666