성인 Drosophila 두뇌 장착: 공초점 이미징에 대 한 슬라이드를 준비 하는 방법

Overview

이 비디오는 교량 슬라이드 아래 성인 파리에서 온전한 뇌를 장착하는 방법을 설명하고 형광 현미경 검사법을 위해 면역 염색 된 뇌에서 수행 되는 프로토콜을 보여줍니다.

Protocol

이 프로토콜은 켈리 외에서발췌 ., 해부 및 면역 형광 체의 황색 염색 성인 Drosophila 멜라노가스터 뇌에서 광수용체 뉴런, J. Vis. Exp. (2017).

1. 현미경 슬라이드 및 이미징에 성인 D. 멜라노가스터 두뇌장착

1. "브리지" 슬라이드를 빌드합니다. 위치 2 "베이스" 커버립 약 1cm 떨어져 양전하 슬라이드에. 슬라이드의 양전하 측이 위를 향하고 있는지 확인합니다. 도 1 A에도시된 것처럼 손톱 광택으로 슬라이드에 커버립을 부착합니다. 일반적으로 각 베이스 커버 슬립의 3개의 외부 가장자리를 손톱 광택으로 밀봉하여 장착 매체가 이러한 베이스 커버 슬립 아래에 심지하지 않도록 하는 것이 좋습니다. 손톱 광택을 완전히 건조하게 (10 - 15 분) 진행하기 전에.
2. 스테레오현미경 아래에 슬라이드를 놓고 해부된 뇌를 포함하는 장착 미디어 용액을 두 개의 커버립 사이의 공간에 배치합니다. 대비를 높이기 위해 구스넥 라이트를 조작하여 벤치 탑과 평행하게 움직이게 하는 것이 유용합니다.
3. 피펫을 사용하여 슬라이드에서 추가 마운팅 미디어를 제거하여 슬라이드에서 뇌를 피펫하지 않도록 주의하십시오.
4. 여분의 장착 미디어를 멀리 심지. 이것은 두뇌가 다음 단계 도중 더 정확하게 위치될 수 있게 합니다.
5. 한 쌍의 집게와 스테레오현미경을 사용하여 안테나 로브가 위를 향하도록 그리드 패턴으로 슬라이드에 뇌를 배치합니다.
6. 뇌(그림1A)에커버 슬립("다리")을 놓습니다. 손톱 광택을 사용하여 브리지 커버 슬립의 측면을 밀봉하여 "베이스" 커버 슬립에 닿습니다.
7. p200 파이펫을 사용하여 교량 아래의 중앙 캐비티를 신선한 장착매체(그림 1B)로천천히 채웁니다. 중앙 커버슬립의 열린 가장자리에 한 번에 한 방울을 떨어뜨리고 장착 용지가 중앙 브리지 커버슬립 아래에 심지하도록 합니다. 전체 캐비티가 장착 매체로 채워지을 때까지 계속 한 다음 상단과 아래쪽을 명확한 손톱 광택으로 밀봉합니다.
8. 손톱 광택이 건조되면 즉시 슬라이드를 이미지하거나 -20 °C의 가벼운 방광 꽉 슬라이드 상자에 보관하십시오.
9. 1 주일 이내에, 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 이미지 뇌는 발광 레이저와 필터 큐브선택 형광 이차 항체에 적합한. 버섯 바디 뉴런의 Z 스택 이미지는 일반적으로 20X 또는 40X 목표를 사용하여 얻어진다. 망막 광수용체 뉴런의 이미징은 더 높은 배율을 요구할 수 있습니다.

Representative Results

그림 1: 면역 형광 화상 진찰을 위한 준비에 있는 두뇌를 장착합니다. (A)뇌는 뇌의 평평을 방지하기 위해 다리 덮개와 슈퍼 프로스트 플러스 슬라이드에 장착됩니다. 두 개의 "베이스" 커버 슬립은 명확한 손톱 광택과 해부 된 두뇌가 그들 사이의 슬라이드에 배치된 슈퍼 프로스트 플러스 양전하 슬라이드에 부착됩니다. 명확한 "다리" 커버 슬립은 뇌 위에 배치되고 베이스 커버 슬립에 부착됩니다. (B)손톱 광택이 건조되면, 벡타쉴드는 이차 항체의 형광을 보존하기 위해 다리 밑으로 천천히 파이프화된다. 클리어 손톱 광택은 "다리"커버 슬립의 상단과 하단을 밀봉하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
VectaShield	Vector Labs	H-1000
SuperFrost Plus Slides	ThermoFisher	99-910-01
Coverslips	ThermoFisher	12-553-454
fingernail polish	Electron Microscope Services (EMS)	72180
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
Kimwipe	Fisher	06-666