Montaje de cerebros drosophila adultos: un método para preparar diapositivas para imágenes confocales

Overview

Este video describe un método de montaje de cerebros intactos de moscas adultas bajo una diapositiva de puente y muestra el protocolo realizado en cerebros inmunodeprim humanos para microscopía fluorescente.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Kelly et al., Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017).

1. Montaje de cerebros adultos D. melanogaster en diapositivas de microscopio e imágenes

1. Construir una diapositiva de "puente". Coloque dos tapas "base" de aproximadamente 1 cm de distancia en una diapositiva cargada positivamente. Asegúrese de que el lado cargado positivamente de la diapositiva esté orientado hacia arriba. Adhiera las tapas a la diapositiva con el pulido de uñas como se muestra en la Figura 1A. Por lo general, es útil sellar los tres bordes exteriores de cada resbalón de la cubierta base con esmalte de uñas para garantizar que los medios de montaje no se agaden debajo de estos resbalones de cubierta base. Deje que el esmalte de la uña se seque completamente (10 - 15 min) antes de proceder.
2. Coloque la diapositiva debajo del estereomicroscopio y pipetee la solución de medios de montaje que contiene los cerebros diseccionados en el espacio entre las dos cubiertas. Para proporcionar más contraste, es útil maniobrar las luces de cuello de ganso para que sean paralelas con la parte superior del banco.
3. Retire los medios de montaje adicionales de la diapositiva con una pipeta, teniendo cuidado de no pipetear los cerebros de la diapositiva.
4. Wick lejos medios de montaje adicionales. Esto permitirá que los cerebros se coloquen con mayor precisión durante el siguiente paso.
5. Usando un par de fórceps y el estereomicroscopio, coloque los cerebros en la diapositiva en un patrón de cuadrícula con lóbulos antennales mirando hacia arriba.
6. Coloque un resbalón de cubierta (el "puente") sobre el cerebro(Figura 1A). Utilice el esmalte de la uña para sellar los lados del deslizamiento de la cubierta del puente donde se pongan en contacto con los resbalones de la cubierta "base".
7. Usando una pipeta p200, llene lentamente la cavidad central debajo del puente con medios de montaje frescos(Figura 1B). Coloque una gota a la vez en el borde abierto de la cubierta central y permita que el medio de montaje se acueste debajo de la cubierta del puente central. Continúe hasta que toda la cavidad esté llena de medios de montaje, luego selle la parte superior e inferior con un pulido transparente de la uña.
8. Una vez que el esmalte de la uña esté seco, imagine las diapositivas inmediatamente o guárdelas en una caja de diapositivas apretada a prueba de luz a -20 °C.
9. Dentro de una semana, los cerebros de imagen utilizan un microscopio confocal de escaneo láser con láseres de excitación y cubos de filtro apropiados para los anticuerpos secundarios fluorescentes elegidos. Imágenes de pila Z de neuronas corporales de hongos se obtienen típicamente usando objetivos 20X o 40X. Las imágenes de las neuronas fotorreceptores retinianas pueden requerir una mayor magnificación.

Representative Results

Figura 1: Montaje de cerebros en preparación para imágenes de inmunofluorescencia. (A) Los cerebros están montados en diapositivas SuperFrost Plus con una cubierta de puente para evitar el aplanamiento de los cerebros. Dos resbalones de cubierta "base" se adhieren a un tobogán Superfrost Plus cargado positivamente con esmalte de uñas transparentes y cerebros diseccionados se colocan en el deslizamiento entre ellos. Se coloca un resbalón transparente de la cubierta del "puente" por encima del cerebro y se adhiere a los resbalones de la cubierta de la base. (B) Una vez que el esmalte de la uña se ha secado, Vectashield se pipe lentamente bajo el puente para preservar la fluorescencia del anticuerpo secundario. A continuación, se utiliza el esmalte transparente de la uña para sellar la parte superior e inferior del resbalón de la cubierta del "puente". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
VectaShield	Vector Labs	H-1000
SuperFrost Plus Slides	ThermoFisher	99-910-01
Coverslips	ThermoFisher	12-553-454
fingernail polish	Electron Microscope Services (EMS)	72180
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
Kimwipe	Fisher	06-666