Yetişkin Drosophila Beyinlerinin Montajı: Konfokal Görüntüleme için Slayt Hazırlama Yöntemi

Overview

Bu video, bir köprü kaydırağı altında yetişkin sineklerden sağlam beyinleri monte etme yöntemini açıklar ve floresan mikroskopi için bağışıklığı olan beyinlerde gerçekleştirilen protokolü gösterir.

Protocol

Bu protokol Kelly ve ark.,Mantar Vücudunun Diseksiyonu ve İmmünofluoresan Lekelemesi ve Yetişkin Drosophila melanogaster Beyinlerinde Fotoreceptör Nöronları, J. Vis. Exp. (2017) bir alıntıdır.

1. Yetişkin D. melanogaster Beyinlerinin Mikroskop Slaytlarına ve Görüntülemeye MonteSi

1. Bir "köprü" slaytı oluşturun. pozitif yüklü bir slaytta yaklaşık 1 cm arayla iki "taban" kapak kılıfı yerleştirin. Slaydın pozitif yüklü tarafının yukarı dönük olduğundan emin olun. Kapak kapaklarını Şekil 1A'dagösterildiği gibi tırnak cilası ile slayda tutturun. Montaj ortamlarının bu taban kapağı kaymalarının altında fitil oluşturmamasını sağlamak için genellikle her taban kapağının üç dış kenarını tırnak cilası ile kapatmak yararlıdır. Devam etmeden önce tırnak cilası tamamen (10 - 15 dk) kurumaya bırakın.
2. Slaydı stereomikroskopun altına yerleştirin ve parçalanmış beyinleri içeren montaj ortamı çözümünü iki kapak arasındaki boşluğa pipetleyin. Daha fazla kontrast sağlamak için, bektaşi ışıklarını tezgah üstü ile paralel olacak şekilde manevra yapmak yararlıdır.
3. Beyni slayttan çıkarmamaya dikkat ederek, bir pipet kullanarak slayttan ekstra montaj medyasını çıkarın.
4. Ekstra montaj medyasını yok edin. Bu, beyinlerin bir sonraki adım sırasında daha hassas bir şekilde konumlandırılmasını sağlayacaktır.
5. Bir çift önseçim ve stereomikroskop kullanarak, beyinleri slayt üzerinde anten lobları yukarı bakacak şekilde bir ızgara deseni içinde konumlandırın.
6. Beyinlerin üzerine bir kapak kayması ("köprü") yerleştirin (Şekil 1A). Köprü kapağının kenarlarını kapatmak için tırnak cilası kullanın ve burada "taban" kapak kaymalarına temas edin.
7. Bir p200 pipet kullanarak, köprünün altındaki orta boşluğu yavaşça taze montaj ortamı ile doldurun (Şekil 1B). Orta kapak kapağının açık kenarına her seferinde bir damla yerleştirin ve montaj medyasının merkez köprü kapak diliminin altına fitillemesine izin verin. Tüm boşluk montaj ortamı ile doldurulana kadar devam edin, ardından üst ve altını açık tırnak cilası ile kapatın.
8. Tırnak cilası kuruduktan sonra, slaytları hemen görüntüleyin veya -20 °C'de ışık geçirmez sıkı bir slayt kutusunda saklayın.
9. Bir hafta içinde, görüntü beyinleri, seçilen floresan ikincil antikorlara uygun ekscitasyon lazerleri ve filtre küpleri ile lazer taramalı konfokal mikroskop kullanarak. Mantar vücut nöronlarının Z-istifi görüntüleri tipik olarak 20X veya 40X hedefleri kullanılarak elde edilir. Retinal fotoreceptör nöronlarının görüntülenmesi daha yüksek büyütme gerektirebilir.

Representative Results

Şekil 1: İmmünofluoresans görüntülemeye hazırlık için beyinlerin montajı. (A) Beyinler, beyinlerin düzleşmesini önlemek için köprü kapağına sahip SuperFrost Plus slaytlarına monte edilir. İki "taban" kapak kayması, net tırnak cilası ve parçalanmış beyinler ile Superfrost Plus pozitif yüklü bir slayda yapışır ve daha sonra aralarındaki kaydırağa yerleştirilir. Beyinlerin üzerine net bir "köprü" kapak kayması yerleştirilir ve taban kapağı kaymalarına yapışır. (B) Tırnak cilası kuruduktan sonra, Vectashield ikincil antikorun floresanını korumak için köprünün altına yavaşça pipetlendi. Net tırnak cilası daha sonra "köprü" kapak fişinin üstünü ve altını kapatmak için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
VectaShield	Vector Labs	H-1000
SuperFrost Plus Slides	ThermoFisher	99-910-01
Coverslips	ThermoFisher	12-553-454
fingernail polish	Electron Microscope Services (EMS)	72180
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
Kimwipe	Fisher	06-666