Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

דרוזופילה (לא כולל) כימות צומת נוירומוסקולרי (NMJ): שיטה להערכת מורפולוגיה ותפקוד סינפטיים

Overview

הצומת הנוירומוסקולרי דרוזופילה (NMJ) משמש כמודל לחקר המורפולוגיה והתפקוד של הסינפסות. סרטון זה מתאר תכונות חשובות שהחוקרים מכמתים כדי לאפיין את ה- NMJ. פרוטוקול הדוגמה מדגים תוכנה המסוגלת לבצע את הכימות באופן אוטומטי.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Castells-Nobau ואח ',שני אלגוריתמים עבור תפוקה גבוהה וכימות רב פרמטרי של Drosophila Nיורומוסקולרי צומת מורפולוגיה, J. Vis. Exp. (2017).

1. דרישות לפני עיבוד תמונה

  1. בצע את ההכנות לספר פתוח של Drosophila של זחלים נודדים כוכב שלישי (L3), כפי שתואר קודם לכן.
  2. מסופי Drosophila NMJ בשילוב של שני סמנים: Dlg-1 או Hrp יחד עם Brp לניתוח עם "Drosophila NMJ Morphometrics ", ו Syt או Csp יחד עם Brp לניתוח עם "Drosophila NMJ בוטון מורפומטריה ".
    שים לב: נוגדנים מאותו המין יכולים להיות משולבים על ידי תיוג מראש אחד עם ערכת הטיה נוגדנים כגון זנון אלקסה תיוג ערכות.
  3. מסופי NMJ תמונה באמצעות מיקרוסקופ של בחירה, למשל, פלואורסצנטיות (עם או בלי ApoTome) או מיקרוסקופיה confocal.
    1. רכוש מחסנית תמונות דו-ערוצית של מסוף NMJ.
      1. התאם את הגדרות המיקרוסקופ באופן שערוץ 1 רוכש את מסוף NMJ עם Dlg-1 (או Hrp, Syt, Csp) וערוץ 2 מסוף NMJ immunolabeled עם Brp.
      2. באופן אופציונלי, לנתח תמונות חד ערוציות (של סינפסות immunolabeled עם נוגדן יחיד) עם פקודות המאקרו. תמונה NMJs immunolabeled באופן ייחודי עם Dlg-1 או Hrp לניתוח עם "Drosophila NMJ Morphometrics", או Syt או Csp עבור "Drosophila NMJ בוטון מורפומטריה".
        שים לב: לא ניתן לנתח סינפסות immunostained עם אנטי Brp בלבד.
    2. יצא את התמונות שהושגו כקבצי .tiff בודדים. הפוך את סדר הערוצים לפני הפעלת פקודות המאקרו אם לא נרכש כמצוין.

2. דרישות תוכנה והתקנה

  1. הורד את פקודות המאקרו: "דרוזופילה NMJ מורפומטריה " ו "דרוזופילה NMJ בוטון מורפומטריה " מהאתר הבא: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1.
  2. העבר את הסמן לתיקיה "פקודות מאקרו עדכון 1", ולחץ על האפשרות המופיעה "תצוגה". תופיע רשימה עם התוכן של תיקיה זו. התיקיה מכילה את פקודות המאקרו "דרוזופילה NMJ מורפומטריה " ו "דרוזופילה NMJ בוטון מורפומטריה ".
    שים לב: שתי פקודות המאקרו תואמות לגירסאות פיג'י 1.4, המסופקות גם באותה תיקיה. ייתכן שפקודות המאקרו לא יפעלו בגירסאות אחרונות. נא השתמש בגירסה 1.4 שסופקה. אין זה מוכח להפעיל גירסה זו, אפילו במחשבים עם גירסת פיג'י עדכנית יותר הזמינה.
  3. לחץ על "הורד הכל". תוכן התיקיה יורד למחשב כקובץ .zip. בטל את הקליפה של הקובץ שהורד.
  4. העתק את הקבצים Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm ו Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm לספריה Fiji.app/plugins/. בעת הפעלה מחדש של התוכנית, פקודות המאקרו יופיעו בתחתית התפריט הנפתח תוספים.

3. הפעל תת-מאקרו "המר למחסנית" כדי ליצור הקרנות Z ו- Hyperstacks של תמונות NMJ

  1. הפעל את הממשק הגרפי על-ידי בחירת תוספים בסרגל הכלים ובחר"Drosophila NMJ Morphometrics" בתפריט הנפתח.
  2. הגדר את ההגדרה "מחרוזת קובץ ייחודי" בממשק הגרפי של המאקרו.
    שים לב: תוכנת המיקרוסקופ משתמשת בחתימת זיהוי כדי לארגן מישורים וערוצים בעת אחסון ערימות כקבצי '.tiff בודדים. הגדרת מחרוזת הקבצים הייחודית שהוזנה צריכה לציין את החתימה שהוקצתה על-ידי התוכנה למישור הראשון של הערוץ הראשון (חשוב: יש לציין את המישור הנמוך ביותר ואת מספר הערוץ).
  3. בחר רק את מאקרו המשנה "המר למחסנית" ולחץ על "אישור" ובחר את התיקיה שבה ממוקמות התמונות. אם נבחרה ספריה ראשית עם מספר תיקיות משנה, כל קבצי '.tiff בודדים בתוך הספריה הראשית ותיקיית המשנה התואמים לקריטריוני מחרוזת הקבצים הייחודיים יעובדו.
    1. אם מחסנית z מכילה ערוץ אחד בלבד, בחר בתיבה "ערוץ 1 בלבד".
  4. שים לב שיופיעו שני קבצים חדשים לתמונת NMJ, המוגדרים כברירת מחדל stack_image_name flatstack_image_name. אחסן רק את המחסנית והתרמיל השטוחים האלה לניתוח נוסף. ניתן למחוק בשלב זה את סידרת הקבצים .tiff, תוך מזעור קיבולות האחסון הנדרשות והימנעות ממקורות שגיאה פוטנציאליים.

4. הפעל תת-מאקרו "הגדר החזר על ההשקעה" כדי לתאם את מסוף העניין של NMJ

  1. התחל את הממשק הגרפי של "דרוזופילה NMJ מורפומטריה ".
  2. בחר רק בתיבת הסימון "הגדר החזר על ההשקעה" ולחץ על "אישור" ובחר את הספריה הראשית שבה מאוחסנות התמונות שכותרתן flatstack_name ולחץ על "בחר". מאקרו המשנה "הגדר החזר על ההשקעה" מחפש באופן אוטומטי בכל תיקיות המשנה בספריה הראשית שנבחרה.
  3. עם פתיחת ההקרנה הראשונה, בחרו בכלי "בחירות ביד חופשית" בסרגל הכלים.
  4. באמצעות העכבר לצייר בחירה המכילה באופן בלעדי את מסוף NMJ המלא של עניין ולחץ על "אישור" בחלון "הגדר מסוף". המאקרו ימשיך עם התחזית הבאה.
  5. סמן את ההחזר הבא על ההשקעה וחזור על הפעולה עד להגדרת כל ההחזרים על ההשקעה. קובץ תמונת ההחזר על ההשקעה, בשם "roi_image_name", יאוחסן באותה ספריה כמו תמונות המחסנית וההקרנה שנוצרו קודם לכן עבור כל אחת מהתמונות המעובדות. הפלט של מאקרו משנה זה הוא תמונה בינארית של ההחזר על ההשקעה בלבן על רקע שחור.

5. הפעל תת-מאקרו "נתח" כדי לכמת תכונות מסוף NMJ

  1. עבור אל סרגל הכלים, בחר "תוספים" והשתמש:
    "Drosophila_NMJ_Morphometrics" בעת ניתוח סינפסות immunolabeled עם אנטי Dlg-1 או אנטי Hrp (ערוץ 1) יחד עם אנטי Brp (ערוץ 2), או "Drosophila_NMJ_Bouton_Morphometrics" בעת ניתוח סינפסות immunolabeled עם אנטי Syt או anti-Csp (ערוץ 1) יחד עם Brp (ערוץ 2).
    1. כאשר יש לנתח ערימות תמונה של ערוץ אחד (הערוץ המבני Dlg-1 או HRP עבור "Drosophila_NMJ_Morphometrics", או Syt או Csp עבור "Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics "), בחר בתיבה "ערוץ 1 בלבד".
  2. התאם את קנה המידה המתאים לתמונות שיש לנתח.
    1. אם פיקסל אחד בתמונה מתאים ל- 2.5 מיקרומטר, ציין Scale-Pixels = 1, מרחק קנה מידה ב- μm = 2.5. במקרה ששתי ההגדרות יישארו ב- 0, אזור NMJ, ההיקף, האורך ואורך הענף הארוך ביותר יתבטאו במספר פיקסלים.
  3. במידת הצורך, התאם את הגדרות הניתוח המהוות ברירת מחדל של המאקרו. בצע התאמות רק אם מאקרו המשנה "Analyze" מופעל בעבר עם תוצאות לא משביעות רצון (ראה סוף סעיף זה וסעיף 6 לקבלת הוראות למיטוב ההגדרות).
  4. בחר בתיבות הסימון "נתח" ו"המתן" ולחץ על "אישור".
    1. בחר בתיבת הסימון "המתן" בעת הפעלת מאקרו המשנה "נתח" בתמונות 2 ערוצים. אחרת, שגיאות בספירת אזורים פעילים עלולות להתרחש עקב קיבולות מחשב מוגבלות.
  5. כאשר נפתח חלון חדש "בחר ספריה", בחר את הספריה שבה ממוקמות התמונות ולחץ על "בחר". המאקרו ינתח את כל התמונות המאוחסנות בספריה הראשית, ואם ישים, את התיקיות הבאות (באמצעות שלושת הקבצים מהפעלת פקודות המאקרו הקודמות: stack_image_name, flatstack_image_name roi_image_name). המאקרו מעבד כל תמונה בנפרד וברוצה. פעולה זו יכולה להימשך מספר דקות לכל מחסנית תמונות (בהתאם לקיבולת המחשב).
  6. לאחר הפעלת המאקרו, שים לב שקובץ תמונה חדש בשם res_image_name עבור כל סינפסה מנותחת המאוחסנת ייווצר בתיקיית ההורים. המדידות הכמותיות יאוחסנו כקובץ "תוצאות.txt".
  7. בדוק את כל תמונות התוצאות כדי לזהות ולא לכלול תמונות עם שגיאות פילוח. שגיאות פילוח אפשריות מתוארות בטבלה 1, יחד עם עצות כיצד להתאים הגדרות כדי לעקוף שגיאות אלה. תמונות תוצאה עם שגיאות פילוח כאלה מוצגות כדוגמאות באיור 1.
    שים לב: בעת הפעלת המאקרו עם הגדרות ברירת המחדל שנצפו בממשק המשתמש, היה דיוק של כ- 95% בעת השוואת הערכת מאקרו להערכה ידנית.

6. התאם את הגדרות המאקרו לתמונות

  1. כאשר יותר מ- 5% מהתמונות מציגות שגיאות פילוח, סייר באלגוריתמים השונים כדי להגדיר/לבחור את הגדרות המאקרו המתאימות ביותר עבור התמונות.
  2. התאמת ערך רדיוס כדור מתגלגל
    שים לב: פונקציית רדיוס הכדור המתגלגל מחסירה את הרקע של התמונה. פונקציה זו היא בעלת חשיבות מכרעת בעת עבודה עם תמונות שנרכשו על מיקרוסקופים פלואורסצנטיים ו / או כאשר תמונות יש רעש רקע גבוה. חיסור הרקע יסייע לשלבי הסף האוטומטיים של המאקרו לייצר פילוח הולם של מסופי NMJ.
    1. בחר שלוש תמונות NMJ stack_image_name שנוצרו על-ידי מאקרו המשנה "המר למחסנית". בחרו תמונות המייצגות את ערכת הנתונים של התמונה.
    2. בסרגל הכלים, בחר תמונה | | צבע פצל ערוצים. ייווצרו שתי ערימות תמונות, האחת מייצגת את ערוץ 1 והשנייה את ערוץ 2, בהתאמה ותשמור אותן.
    3. פתח את מחסנית התמונה השייכת לערוץ 1 פתוח, המתאים Dlg-1, Hrp, Syt או Csp immunolabeling.
    4. הפעל את המסנן "חיסור רקע" על-ידי בחירה באפשרות "תהליך" בסרגל הכלים ואחריו "חיסור רקע..." בתפריט הנפתח.
    5. לחץ על תיבת הסימון תצוגה מקדימה בחלון המוקפץ ולהתאים את רדיוס הכדור מתגלגל לערך המתאים ביותר עבור התמונות. יש להתאים את ההגדרה "רדיוס כדור מתגלגל" לערכים המגבירים את הניגודיות בין הסינפסה לרקע (ראו איור 2A').
      1. ראו איור 2 כדוגמה. בחלונית A, חלקים מהסינפסה מציגים את אותן רמות אפורות כמו הרקע, ואילו בחלונית איור 2 A' "רדיוס כדור מתגלגל" של 500 גורם לניגודיות חזקה בין הסינפסה לרקע.
    6. יצירת הקרנת z על-ידי בחירה בסרגל הכלים תמונה | מחסנית| הקרנת Z, בחר סוג הקרנה = עוצמה מרבית ושמור את התמונה המתקבלת. כאשר מוגדר הערך המתאים לרדיוס הכדור המתגלגל, הפעל את האלגוריתם "חיסור רקע" בתמונות הייצוג הנותרות עם אותו ערך רדיוס כדור מתגלגל. צור את הקרנות Z ושמור אותן (בכל ספריה).
      שים לב: ערך רדיוס הכדור המתגלגל לתמונות של 8 סיביות או RGB צריך להיות גדול לפחות כמו הרדיוס של האובייקט הגדול ביותר בתמונה שאינו חלק מהרקע. לתמונות של 16 סיביות ו- 32 סיביות, הרדיוס צריך להיות פרופורציונלי באופן הפוך לטווח ערכי הפיקסלים.
  3. קביעת הסף האוטומטי השונה שישמש
    1. פתח את תחזיות Z שנשמרו בשלב הקודם (6.2.6) ובחר תמונה | כוונון | | אחיזה אוטומטית נסה הכל.
    2. כתמונת תוצאה בינארית בעלת סף, יופיעו עם כל אלגוריתמי הסף האוטומטי השונים, קבעו את האלגוריתם המתאים ביותר לתמונות.
      1. בעת הפעלת המאקרו בהמשך, שנה את הסף בהגדרות המאקרו בהתאם.
      2. השתמש בסף מגביל יותר כגון "RenyiEntrophy" או "Moments" כסף החלוקה לרמות של NMJ וסף מתירני יותר כגון "Li" כדי לקבוע את השלד של NMJ ו- "Huang" כדי לקבוע אזורים פעילים. כאשר התמונות חדות מאוד עם מעט עד ללא רקע, השתמש ב-"Huang" כ" סף חלוקה לרמות של NMJ. אחרת, ייתכן שחלקים מהסינפסה חסרים לאחר פילוח התמונה.
      3. ראו איור 2ב' לדוגמה. פילוח מתאים של הסינפסה מתקבל עם סף אוטומטי מסומן על-ידי תיבות ירוקות. כמה דוגמאות של סף לא מתאים מסומנים על ידי תיבות אדומות (לבדוק סינפסות בהגדלה גבוהה). באחרון, חלקים של הסינפסה חסרים או חלקים של הרקע כלולים.
  4. קביעת הגודל המרבי של החלקיקים הקטנים
    שים לב: פונקציה זו לא תכלול את כל החלקיקים שזוהו על-ידי סף החלוקה לרמות של NMJ ואת סף השלד הקטנים מהערך המוגדר ב"הגדרת החלקיקים הקטנים" מהניתוח. ערך זה מוגדר בפיקסלים. פונקציה זו משמשת כמסנן רעש והיא שימושית מאוד כאשר שיעורים גבוהים של רקע לא אחיד (כגון גבישים / אבק) נמצאים בתמונות שהושגו.
    1. פתח את תחזיות Z שנשמרו בשלב 6.2.6. ולהגדיר את קנה המידה כדי לזהות את מספר הפיקסלים באמצעות ניתוח | הגדר קנה מידה. החל את ההגדרות הבאות: מרחק בפיקסלים = 1, מרחק ידוע = 1, יחסי גודל פיקסל = 1, יחידת אורך = פיקסל ולחץ על "אישור". לחץ על הכלי "בחירה אליפטית" בסרגל הכלים.
    2. באמצעות העכבר לצייר בחירה המקיפה חלקיקים בודדים הנמצאים immunostaining אבל לא שייכים NMJ. הקש Ctrl+m עבור משתמש Windows או cmd+m עבור משתמשי Mac. ייפתח חלון תוצאות המציין את אזור החלקיקים שנבחרו במספר פיקסלים.
    3. חזור על השלב הקודם מספר פעמים עם מספר חפצים נוכחים בתמונות כדי לקבוע את החלקיקים המזהמים הגדולים ביותר / אזור חפץ. ערך זה יהיה הערך שיש להגדיר בהגדרה בעת הפעלת המאקרו בהמשך. בעת הפעלת המאקרו להגדיר את "גודל חלקיקים קטנים" כגודל החלקיקים הקטן ביותר נצפתה מוגלה שוליים של 25%.
    4. ראו איור 2D לדוגמה. הגביש הגדול ביותר שזוהה יש שטח של 112 פיקסלים. יש להגדיר את ההגדרה "גודל חלקיקים קטנים", בעת עיבוד תמונה זו עם המאקרו, ל- 125 - 150.
  5. קביעת גודל בוטון מינימלי
    שים לב: פונקציה זו לא תכלול את כל הבוטונים שזוהו על-ידי סף החלוקה לרמות של NMJ הקטנים מהערך המוגדר מהניתוח. ערך זה מוגדר בפיקסלים.
    1. בצע את אותם שלבים כמתואר בסעיף 6.4, אך במקרה זה צייר מבחר המקיף את הבוטונים הקטנים ביותר הקיימים במסוף NMJ. בחר את האזור הקטן ביותר המתאים לבוטון הקטן ביותר של האזורים הנמדדים. זהו הערך שיש להגדיר בהגדרת גודל ה-bouton המינימלי בעת הפעלת המאקרו בהמשך.
  6. הגדרת ערך "עמידות לרעש מקסימה"
    1. כדי להגדיר את הערך "מצא עמידות לרעש מקסימה" עבור המאקרו, פתח את מחסנית Z של ערוץ 2 שנשמרה בסעיף 6.2.2.
    2. עבור לכרטיסיה תוספים בתפריט המוקפץ, בחר עבד | מרבי(תלת-ממד), וכאשר מופיע maximum_image_name (שעשוי להימשך מספר דקות), סגור את ערימת התמונות המקורית.
    3. בחרו Maximum..._image_name (מחסנית התמונות החדשה שהתקבלה) ובחרו 'תוספים' | | תהליך מינימום (3D), כאשר התמונה החדשה מינימום של Maximum..._image_name apears לסגור את מקסימום... _image_name מחסנית.
    4. בסרגל הכלים, בחר עבד | מצא את מקסימה.... חלון חדש "מצא את מקסימה..." ייפתח. לחץ על תיבת הסימון "בחירת נקודת תצוגה מקדימה..." ולמלא את התיבה "רגישות לרעש" בהגדרת המאקרו המוגדרת כברירת מחדל 50. נקודות המקסימום יצוין בתמונה כמו צלבים קטנים.
      1. הגדל את הערך "עמידות לרעש" אם אתה מבחין בעודף של אזורים פעילים מבוארים, כלומר צלבים שאינם נמצאים מעל אזורים פעילים שאינם ממוקדים במישור המחסנית שנבחר, או אזורים פעילים מזויפים שזוהו ברקע.
        1. מצד שני, אם התבוננות באזורים פעילים מבוארים באופן חלקי, כלומר אזורים פעילים בפוקוס שאינם מזוהים, להקטין את הערך "מקסימום עמידות לרעש". המשך לנסות ערכים שונים לאחר הליך זה עד שהצלבים יתייגו כראוי אזורים פעילים הנמצאים במוקד. מלא את "מצא עמידות לרעש מקסימה" בערך זה.
        2. ראו איור 2C לדוגמה. זוהו אזורים פעילים רבים מדי. באיור 2C' רק האזורים הפעילים הנמצאים במוקד מזוהים בעת הגדלת הערך "עמידות לרעש של Maxima".
    5. הפעל את מאקרו המשנה "נתח" עבור התמונות המייצגות שנבחרו בשלב 5.1, כאשר ההגדרות מוגדרות בכל השלבים הקודמים.
  7. התאמת הסף התחתון והעליון של Brp-puncta
    1. שים לב שקובץ חדש יופיע לאחר הפעלת המאקרו לפי שלב 6.6, הנקרא 2_active_zone_stack_image_name. בערימת תמונה זו האזורים הפעילים שזוהו על-ידי הפונקציה "Find maxima" מסומנים על-ידי נקודות לבנות בכל מישור.
    2. פתח קובץ זה על-ידי גרירה ושחרור שלו בסרגל הכלים ובחר תמונה | מחסנית | | פרוייקט Z סוג הקרנה = פרוסות סכום. תושג הקרנה של 2_active_zone_stack_image_name.
    3. בחר תמונה | כוונון | הסף. ייפתח חלון חדש "סף". החלק את הסרגל העליון כדי לבחור ערך סף שבו, כל הנקודות החיוביות הרצויות של מוקדים/Brp מוצגות באופן חזותי באדום.
      שים לב: אם הסף מוגדר נמוך מדי, ייספר עודף של אזורים פעילים. אם מוגדר גבוה מדי, חלק מהאזורים הפעילים יחסר.
      1. ראו איור 2E לדוגמה. כאשר הסף מוגדר ל- 400, רוב האזורים הפעילים (המסומנים כציקד פיקסל אחד) אינם נכללים בסגמנטציה, מכיוון שהם אינם מסומנים באדום (איור 2E). כאשר הסף מוגדר לערך של 50, כל האזורים הפעילים מסומנים באדום (איור 2E).
    4. הגדר ערך זה כסף מינימלי. השאר את "סף פנצ'טה עליון" על הערך המרבי.
    5. הפעל מחדש את תת המאקרו "נתח" עבור התמונות המייצגות עם ההגדרות המוגדרות בכל השלבים הקודמים של סעיף זה. הערך באופן קריטי את קבצי התמונה המתקבלים וודא שהפילוח נעשה כראוי. אם זה לא המקרה, האם מחדש את ההגדרות בהתאם לאופי שגיאות הפילוח (איור 1, טבלה 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 1
איור 1: דוגמאות לתוצאות לא הולמות של פילוח מאקרו. תוצאות תמונות לאחר הפעלת "Drosophila NMJ מורפומטריה" או "Drosophila NMJ בוטון מורפומטריה". חלקים של המסוף הסינפטי אינם כלולים בחלוקה לרמותהצהובה( A ). חלקים מהרקע כלולים במסוף הסינפטי על ידי המיתאר הצהוב (B). קו השלד הכחול משתרע מעבר למסוף הסינפטי(C - D). אזורים פעילים רבים מדי מזוהים (E - E '). אזורים פעילים מסוימים נשארים מבלי שיבחינו בניתוח (G - G '). אזורים פעילים מזוהים מחוץ לסינפסה (F). פילוח בוטון שגוי (ישים רק בעת הפעלת Drosophila NMJ בוטון Morphometrics), boutons הם החמיצו (H) או boutons רבים מדי מזוהים על ידי פילוח (I). חלקיקים כגון גבישים או אבק שהם חלק מהרקע כלולים בפילוח (J). מידע כיצד לשנות הגדרות כדי למנוע שגיאות אלה מסופק בטבלה 1. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: דוגמאות להתאמות של הגדרת מאקרו ולהשלכותיהן על פילוח תמונה. (A) הפחת תצוגה מקדימה ברקע של סינפסה אימונולה Dlg-1, בתמונה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם ApoTome, כאשר "רדיוס כדור מתגלגל" מוגדר 20 (A) או 500 (A '). (B) תמונות פלט שהושגו לאחר הפעלת תמונה | כוונון | | סף אוטומטי נסה את כל פילוחי התמונה המתקבלים על-ידי 16 אלגוריתמי הסף האוטומטי השונים. (C) "מצא את מקסימה" תצוגה מקדימה בעת הגדרת "עמידות לרעש" ב 50 (C) ו 500 (C '); אזורים פעילים שזוהו על-ידי הפילוח מסומנים בצלב קטן. (D) מדידה של "חלקיקים קטנים" המופיעים ברקע התמונה של סינפסה immunolabeled עם אנטי Hrp, בתמונה על מיקרוסקופ confocal. (ה)הקרנת "סכום פרוסות" המתקבלת 2_active_zone_stack_ima-ge_name. הסף נקבע על 400 (E) ועל 50 (E '). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

פילוח שגיאות שנצפו דוגמה התאמות נדרשות
שטח והיקף NMJ
(מיוצג על-ידי קו מיתאר צהוב בתמונת התוצאה)
חלקים מהמסוף הסינפטי אינם כלולים
בחלוקה לרמות הצהובה או בחלקים מהרקע
כלולים במסוף הסינפטי המתואר בצהוב.
איור 2A-B התאימו את הערך 'רדיוס כדור מתגלגל'.
ראה סעיף 6.1.
התאם את 'סף החלוקה לרמות של NMJ'.
ראה סעיף 6.2.
פרמטרים קשורים באורך NMJ
(מיוצג על ידי קו שלד כחול בתמונת התוצאות)
קו השלד הכחול משתרע מעבר או
אינו קיים לאורך כל המסוף הסינפטי.
איור 2C-D התאימו את הערך 'רדיוס כדור מתגלגל'.
ראה סעיף 6.1.
התאם את 'סף החלוקה לרמות של NMJ'.
ראה סעיף 6.2.
פנצ'טה חיובית Brp
(מיוצג על-ידי נקודות בתמונת התוצאות)
זוהו אזורים פעילים רבים מדי. איור 2E-E' הקטן את הערך 'מצא עמידות לרעש מקסימה'.
ראה סעיף 6.5.
פנצ'טה חיובית Brp
(מיוצג על-ידי נקודות בתמונת התוצאות)
הניתוח מפספס אזורים פעילים. איור 2G-G' הגדילו את הערך 'מצא עמידות לרעש מקסימה'.
ראה סעיף 6.5.
הקטן את 'סף Brp-puncta נמוך יותר'.
ראה סעיף 6.6.
פנצ'טה חיובית Brp
(מיוצג על-ידי נקודות בתמונת התוצאות)
זוהו פריטים חזותיים של אזור פעיל
מחוץ למסוף הסינפטי.
איור 2F התאם את סעיף 6.2 לסעיף 'סף אזור פעיל'. הגדל את 'סף Brp-puncta נמוך יותר'.
ראה סעיף 6.6.
חלקיקים קטנים חלקיקים כאלה גבישים או אבק כי הם חלק
של הרקע נראה להיכלל ב
הפילוח.
איור 2J בחר את התיבה 'הסר חלקיקים קטנים'.
ראה סעיף 6.3.
לקבוע חלקיקים קטנים בגודל המרבי.
ראה סעיף 6.3.
פילוח בוטון פילוח בוטון שגוי
(ישים רק על דרוזופילה NMJ בוטון מורפומטריה;
אין להשתמש בדרוזופילה NMJ מורפומטריה לפילוח בוטון).
איור 2H-I התאם את 'סף החלוקה לרמות של NMJ'.
ראה סעיף 6.1.
קבע 'גודל בוטון מינימלי'.
ראה סעיף 6.4.

טבלה 1: מדריך לפתרון בעיות עבור סוגים שונים של שגיאות בפילוח תמונה שניתן להפיק על-ידי פקודות המאקרו. טבלה זו מתארת סוגים שונים של שגיאות פילוח תמונה שנוצרו על-ידי פקודות המאקרו. אלה ניתן לזהות בקלות בתמונות התוצאות. דוגמאות לכל סוג שגיאה מוצגות באיור 1. ב"מקטע ההתאמות" של הטבלה, ההגדרות שיש להתאים מסומנות והמשתמש מופנה לשלב המשנה הקריטי של סעיף 6, המתאר כיצד להתאים הגדרות אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Immunostaining Dilution
Mouse anti-discs large 1 Developmental Studies Hybridoma Bank AFFN-DLG1-4D6 1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Rabbit anti-horseradish peroxidase Jackson IR 323-005-021 1/500
Rabbit anti-Synaptotagmin Gift from Hugo Bellen Jan-00
Mouse anti-Cysteine string protein Developmental Studies Hybridoma Bank DCSP-1(ab49) 1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Mouse anti-Bruchpilot Developmental Studies Hybridoma Bank nc82 Jan-50
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 Life technologies A11029 1/200
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 Life technologies A11011 1/500
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit ThermoFisher Z25006
ProLong Gold Antifade Mountant ThermoFisher P36930
Equipment
Confocal microscope or fluorescence microscope Leica SP5
Zeiss Axio imager
Computer Mac or Pc
Software
FIJI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Tags

ערך ריק הנפקה
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter