ड्रोसोफिला न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) क्वांटिफिकेशन: सिनैप्टिक आकृति विज्ञान और फ़ंक्शन का आकलन करने की एक विधि

Overview

ड्रोसोफिला न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) का उपयोग सिनैप्स के आकृति विज्ञान और कार्य का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में किया जाता है। यह वीडियो महत्वपूर्ण विशेषताओं का वर्णन करता है जो शोधकर्ताओं ने एनएमजे की विशेषता के लिए मात्रा निर्धारित की है। उदाहरण प्रोटोकॉल एक सॉफ्टवेयर को दर्शाता है जो स्वचालित रूप से मात्राकरण करने में सक्षम है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल कास्टेल्स-नोबाउ एट अलसे एक अंश है, उच्च-थ्रूपुट के लिए दो एल्गोरिदम और ड्रोसोफिला एनयूरोमस्कुलर जंक्शन आकृति विज्ञान, जे विस एक्सपीके मल्टी-पैरामेट्रिक क्वांटिफिकेशन। (2017).

1. इमेज प्रोसेसिंग से पहले की आवश्यकताएं

1. पहले वर्णित तीसरे इंस्टार घूमते लार्वा (एल 3) की ड्रोसोफिला खुली पुस्तक तैयारी करें।
2. दो मार्कर के संयोजन का उपयोग करके सह-इम्यूनोब्लेल ड्रोसोफिला एनएमजे टर्मिनल: डीएलजी-1 या एचआरपी ने बीआरपी के साथ"ड्रोसोफिला एनएमजे मॉर्फोमेट्रिक्स" के साथ विश्लेषण के लिए बीआरपी के साथ, और सिट या सीएसपी के साथ"ड्रोसोफिला एनएमजे बोवोन मॉर्फोमेट्रिक्स" के साथ विश्लेषण के लिए एक साथ।
   नोट: एक ही प्रजाति के एंटीबॉडी को प्री-लेबलिंग द्वारा एक एंटीबॉडी-कंजूगेशन किट जैसे ज़ेन एलेक्सा लेबलिंग किट के साथ जोड़ा जा सकता है।
3. छवि एनएमजे टर्मिनल पसंद के माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हुए, उदाहरण के लिए, फ्लोरेसेंस (एपोटॉम के साथ या बिना) या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी।
   1. एनएमजे टर्मिनल के 2-चैनल इमेज स्टैक प्राप्त करें।
      1. माइक्रोस्कोप सेटिंग्स को इस तरीके से समायोजित करें कि चैनल 1 डीएलजी-1 (या एचआरपी, सिट, सीएसपी) और चैनल 2 एनएमजे टर्मिनल इम्यूनोलबेलेड के साथ एनएमजे टर्मिनल इम्यूनोलेबल हो जाता है।
      2. वैकल्पिक रूप से, मैक्रो के साथ एक चैनल छवियों (एक एंटीबॉडी के साथ सिनेप्सेस इम्यूनोलेबल) का विश्लेषण करें। इमेज एनएमजेएस इम्यूनोलेबल डीएलजी-1 या एचआरपी के साथ विश्लेषण के लिए"ड्रोसोफिला एनएमजे मॉर्फोमेट्रिक्स", या"ड्रोसोफिला एनएमजे बोटन मॉर्फोमेट्रिक्स" के लिए सिट या सीएसपी के साथ विश्लेषण के लिए विशिष्ट रूप से लेबल किया गया है।
         नोट: केवल एंटी-बीआरपी के साथ सिनेप्स इम्यूनो दाग का विश्लेषण करना संभव नहीं है।
   2. प्राप्त छवियों को व्यक्तिगत .tiff फाइलों के रूप में निर्यात करें। यदि संकेत के अनुसार अधिग्रहीत नहीं किया जाता है तो मैक्रो को चलाने से पहले चैनल ऑर्डर को उलटें।

2. सॉफ्टवेयर आवश्यकताएं और स्थापना

1. मैक्रो डाउनलोड करें:"ड्रोसोफिला एनएमजे मॉर्फोमेट्रिक्स" और"ड्रोसोफिला एनएमजे बोटन मॉर्फोमेट्रिक्स" निम्नलिखित वेबसाइट से: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1।
2. कर्सर को फ़ोल्डर "मैक्रो अपडेट 1" पर ले जाएं, और दिखने वाले विकल्प "देखें" पर क्लिक करें। इस फ़ोल्डर की सामग्री के साथ एक सूची दिखाई देगी। फोल्डर में मैक्रो"ड्रोसोफिला एनएमजे मॉर्फोमेट्रिक्स" और"ड्रोसोफिला एनएमजे बोटन मॉर्फोमेट्रिक्स" शामिल हैं।
   नोट: दोनों मैक्रो फिजी संस्करण 1.4 के साथ संगत हैं, जो एक ही फ़ोल्डर में भी प्रदान किया जाता है। मैक्रो हाल के संस्करणों पर नहीं चल सकता है । कृपया प्रदान किए गए संस्करण 1.4 का उपयोग करें। इस संस्करण को शुरू करना असमस्याग्रस्त है, यहां तक कि हाल ही में फिजी संस्करण उपलब्ध वाले कंप्यूटरों पर भी।
3. "सभी डाउनलोड" पर क्लिक करें। फोल्डर कंटेंट को .zip फाइल के तौर पर कंप्यूटर में डाउनलोड किया जाएगा। डाउनलोड की गई फ़ाइल को अनज़िप करें।
4. Fiji.app/plugins/ निर्देशिका के लिए ड्रोसोफिला_NMJ_Morphometrics.ijm और ड्रोसोफिला_NMJ_Bouton मॉर्फोमेट्रिक्स.ijm फाइलों की प्रतिलिपि करें। कार्यक्रम को पुनः आरंभ करते समय, मैक्रो प्लगइन्स ड्रॉपडाउन मेनू के नीचे दिखाई देंगे।

3. NMJ छवियों के जेड-अनुमानों और हाइपरस्टैक बनाने के लिए उप-मैक्रो "स्टैक में परिवर्तित" चलाएं

1. टूलबार में प्लगइन्स का चयन करके ग्राफिकल इंटरफेस शुरू करें और ड्रॉपडाउन मेनू में"ड्रोसोफिला एनएमजे मॉर्फोमेट्रिक्स" चुनें।
2. मैक्रो के ग्राफिकल इंटरफेस में "यूनिक फाइल स्ट्रिंग" सेटिंग को परिभाषित करें।
   नोट: माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर व्यक्तिगत '.tiff फ़ाइलों के रूप में ढेर भंडारण करते समय विमानों और चैनलों को व्यवस्थित करने के लिए एक पहचान हस्ताक्षर का उपयोग करता है। प्रवेश अद्वितीय फ़ाइल स्ट्रिंग सेटिंग पहले चैनल के पहले विमान के लिए सॉफ्टवेयर द्वारा सौंपा हस्ताक्षर निर्दिष्ट करने की जरूरत है (महत्वपूर्ण: सबसे कम विमान और चैनल संख्या को इंगित करने की जरूरत है) ।
3. केवल उप-मैक्रो "स्टैक में परिवर्तित करें" चुनें और "ओके" पर क्लिक करें और फ़ोल्डर का चयन करें जहां छवियां स्थित हैं। यदि कई सबफोल्डर्स के साथ एक मुख्य निर्देशिका का चयन किया जाता है, तो अद्वितीय फ़ाइल स्ट्रिंग मानदंडों से मेल खाने वाले मुख्य निर्देशिका और उपफोल्डर के भीतर सभी व्यक्तिगत .tiff फ़ाइलें संसाधित की जाएंगी।
   1. यदि जेड-स्टैक में केवल एक चैनल होता है, तो बॉक्स "चैनल 1 केवल" का चयन करें।
4. ध्यान दें कि एनपीजे छवि के अनुसार दो नई फाइलें, डिफ़ॉल्ट रूप से stack_image_name और flatstack_image_name दिखाई देंगी। आगे के विश्लेषण के लिए केवल इन ढेर और फ्लैटस्टैक को स्टोर करें। .tiff फ़ाइल श्रृंखला को इस बिंदु पर हटाया जा सकता है, आवश्यक भंडारण क्षमताओं को कम करना और संभावित त्रुटि स्रोतों से बचना।

4. ब्याज की NMJ टर्मिनल चित्रित करने के लिए उप मैक्रो "आरओआई को परिभाषित करें" चलाएं

1. "ड्रोसोफिला एनएमजे मॉर्फोमेट्रिक्स" का ग्राफिकल इंटरफेस शुरू करें।
2. केवल चेकबॉक्स "आरओआई को परिभाषित करें" और "ओके" दबाएं और मुख्य निर्देशिका का चयन करें जहां flatstack_name हकदार छवियों को संग्रहीत किया जाता है और "चुनें" दबाएं। उप-मैक्रो "परिभाषित आरओआई" चयनित मुख्य निर्देशिका के भीतर सभी सबफोल्डर्स के माध्यम से स्वचालित रूप से खोज करता है।
3. जैसे ही पहला प्रक्षेपण खुलता है, टूलबार में "फ्रीहैंड चयन" उपकरण का चयन करें।
4. माउस का उपयोग करना एक चयन आकर्षित करता है जिसमें विशेष रूप से ब्याज का पूरा एनएमजे टर्मिनल होता है और विंडो "परिभाषित टर्मिनल" में "ओके" पर क्लिक करें। मैक्रो अगले प्रक्षेपण के साथ आगे बढ़ेगा ।
5. अगले आरओआई को चित्रित करें और तब तक दोहराएं जब तक कि सभी आरओआई परिभाषित न हो जाएं। "roi_image_name" नाम की आरओआई छवि फ़ाइल को प्रत्येक प्रसंस्कृत छवियों के लिए पहले से उत्पन्न स्टैक और प्रक्षेपण छवियों के समान निर्देशिका में संग्रहीत किया जाएगा। इस उप-मैक्रो का आउटपुट काले रंग की पृष्ठभूमि पर सफेद रंग में आरओआई की बाइनरी छवि है।

5. एनएमजे टर्मिनल सुविधाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए उप-मैक्रो "विश्लेषण" चलाएं

1. टूलबार पर जाएं, "प्लगइन्स" का चयन करें और उपयोग करें:
   "ड्रोसोफिला_NMJ_Morphometrics" जब एंटी-डीएलपीपी (चैनल 2), या"ड्रोसोफिला_NMJ_Bouton_Morphometrics) के साथ एंटी-बीआरपी (चैनल 2) के साथ सिनेप्स इम्यूनोलेबल का विश्लेषण करते समय एनएनपी (चैनल 2) के साथ एंटी-सीट या एंटी-सीएसपी (चैनल 1) के साथ सिनेप्स इम्यूनोलेबल का विश्लेषण करते हैं।
   1. जब एक चैनल छवि के ढेर का विश्लेषण किया जाना है ("Drosophila_ NMJ_Morphometrics"के लिए संरचनात्मक चैनल डीएलजी-1 या एचआरपी, या"ड्रोसोफिला_NMJ__Bouton_Morphometrics" के लिए सिट या सीएसपी), बॉक्स "केवल चैनल 1" का चयन करें।
2. विश्लेषण किए जाने वाले चित्रों के अनुरूप पैमाने को समायोजित करें।
   1. यदि छवि में एक पिक्सेल 2.5 माइक्रोन से मेल खाता है, तो स्केल-पिक्सल = 1, स्केल-डिस्टेंस को μm = 2.5 में इंगित करें। यदि दोनों सेटिंग्स 0 पर छोड़ दी जाती हैं, तो एनएमजे क्षेत्र, परिधि, लंबाई और सबसे लंबी शाखा लंबाई पिक्सल की संख्या में व्यक्त की जाएगी।
3. यदि आवश्यक हो, तो मैक्रो की डिफ़ॉल्ट विश्लेषण सेटिंग्स को समायोजित करें। समायोजन तभी करें जब उप-मैक्रो "विश्लेषण" पहले असंतोषजनक परिणामों के साथ चलाया गया हो (इस अनुभाग का अंत देखें, और सेटिंग्स को अनुकूलित करने के निर्देशों के लिए धारा 6)।
4. चेकबॉक्स "विश्लेषण" और "प्रतीक्षा" चुनें और "ओके" दबाएं।
   1. 2 चैनल छवियों पर उप-मैक्रो "विश्लेषण" चलाते समय "प्रतीक्षा" चेक बॉक्स चुनें। अन्यथा सक्रिय क्षेत्र गणना में त्रुटियां सीमित कंप्यूटर क्षमताओं के कारण हो सकती हैं।
5. एक नई विंडो "एक निर्देशिका चुनें" के रूप में खुलता है, निर्देशिका का चयन करें जहां छवियां स्थित हैं और "चुनें" दबाएं। मैक्रो मुख्य निर्देशिका में संग्रहीत सभी छवियों का विश्लेषण करेगा और, यदि लागू हो, तो बाद के फ़ोल्डर (पिछले उप-मैक्रो को निष्पादित करने से तीन फ़ाइलों का उपयोग करके: stack_image_name, flatstack_image_name और roi_image_name)। मैक्रो प्रत्येक छवि को व्यक्तिगत और लगातार संसाधित करता है। यह प्रति छवि स्टैक (कंप्यूटर क्षमता के आधार पर) कई मिनट लग सकते हैं।
6. मैक्रो चलाने के बाद, ध्यान दें कि प्रत्येक विश्लेषण सिनैप्स संग्रहीत के लिए res_image_name नाम की एक नई छवि फ़ाइल पैतृक फ़ोल्डर में बनाई जाएगी। मात्रात्मक माप "परिणाम.txt" फ़ाइल के रूप में संग्रहीत किया जाएगा।
7. विभाजन त्रुटियों के साथ चित्रों का पता लगाने और उन्हें बाहर करने के लिए सभी परिणाम छवियों का निरीक्षण करें। इन त्रुटियों को दरकिनार करने के लिए सेटिंग्स को समायोजित करने की सलाह के साथ-साथ तालिका 1में संभावित विभाजन त्रुटियों का वर्णन किया गया है। इस तरह के विभाजन त्रुटियों के साथ परिणाम छवियों चित्र 1में उदाहरण के रूप में प्रदान की जाती हैं ।
   नोट: जब उपयोगकर्ता इंटरफेस में देखी गई डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स के साथ मैक्रो चल रहा था, तो लगभग 95% की सटीकता थी जब मैक्रो मूल्यांकन की तुलना मैनुअल मूल्यांकन से की गई थी।

6. छवियों के लिए मैक्रो सेटिंग्स समायोजित करें

1. जब 5% से अधिक छवियां विभाजन त्रुटियों को दिखाती हैं, तो छवियों के लिए सबसे उपयुक्त मैक्रो सेटिंग्स को परिभाषित करने/चुनने के लिए विभिन्न एल्गोरिदम का पता लगाएं।
2. रोलिंग बॉल त्रिज्या मूल्य समायोजित करें
   नोट: रोलिंग बॉल रेडियस फंक्शन इमेज की बैकग्राउंड को घटाता है। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर अधिग्रहीत छवियों के साथ काम करते समय यह कार्य महत्वपूर्ण है और/या जब छवियों में उच्च पृष्ठभूमि शोर होता है । पृष्ठभूमि के घटाव से मैक्रो के ऑटो-थ्रेसिंग कदमों को एनएमजे टर्मिनलों के पर्याप्त विभाजन का उत्पादन करने में मदद मिलेगी।
   1. उप-मैक्रो "स्टैक में परिवर्तित" द्वारा उत्पन्न तीन एनएमजे stack_image_name छवियों का चयन करें। ऐसी छवियां चुनें जो इमेज डेटासेट के लिए प्रतिनिधि हों.
   2. टूलबार में, इमेज | का चयन करें रंग | विभाजित चैनल। दो छवि ढेर बनाए जाएंगे, एक चैनल 1 और अन्य चैनल 2 का प्रतिनिधित्व करता है, क्रमशः और उन्हें बचाएं।
   3. चैनल 1 ओपन से संबंधित छवि स्टैक खोलें, जो डीएलजी-1, एचआरपी, सिट या सीएसपी इम्यूनोबेलिंग के अनुरूप है।
   4. टूलबार में "प्रक्रिया" का चयन करके फ़िल्टर "घटाना पृष्ठभूमि" चलाएं जिसके बाद "घटाना पृष्ठभूमि..." ड्रॉपडाउन मेनू में।
   5. पॉप-अप विंडो में पूर्वावलोकन चेकबॉक्स पर क्लिक करें और रोलिंग बॉल त्रिज्या को छवियों के लिए सबसे उपयुक्त मूल्य में समायोजित करें। "रोलिंग बॉल त्रिज्या" सेटिंग को उन मूल्यों में समायोजित किया जाना चाहिए जो सिनेप्स और पृष्ठभूमि के बीच के विपरीत को बढ़ाते हैं (चित्रा 2ए देखें)।
      1. एक उदाहरण के लिए चित्रा 2 देखें। पैनल ए में, सिनेप्स के कुछ हिस्से पृष्ठभूमि के समान ग्रे स्तर दिखाते हैं, जबकि चित्रा 2 पैनल ए में 500 के "रोलिंग बॉल त्रिज्या" के परिणाम सिनेप्स और पृष्ठभूमि के बीच मजबूत विपरीत होते हैं।
   6. टूलबार इमेज | में चयन करके एक जेड-प्रोजेक्शन बनाएं स्टैक| Z-प्रक्षेपण, प्रक्षेपण प्रकार = अधिकतम तीव्रता चुना और परिणामी छवि को बचाने के लिए। जब रोलिंग बॉल त्रिज्या के लिए उपयुक्त मूल्य परिभाषित किया जाता है, तो उसी रोलिंग बॉल त्रिज्या मूल्य के साथ शेष प्रतिनिधि छवियों पर "घटाना पृष्ठभूमि" एल्गोरिदम चलाएं। जेड-अनुमान बनाएं और उन्हें (किसी भी निर्देशिका में) बचाएं।
      नोट: 8-बिट या आरजीबी छवियों के लिए रोलिंग बॉल त्रिज्या मूल्य कम से कम छवि में सबसे बड़ी वस्तु के त्रिज्या जितना बड़ा होना चाहिए जो पृष्ठभूमि का हिस्सा नहीं है। 16-बिट और 32-बिट छवियों के लिए त्रिज्या पिक्सेल मूल्य सीमा के विपरीत आनुपातिक होनी चाहिए।
3. उपयोग किए जाने वाले विभिन्न ऑटो-थ्रेसहोल्ड निर्धारित करें
   1. पिछले चरण (6.2.6) में सहेजे गए जेड-अनुमानों को खोलें और | इमेज का चयन करें | समायोजित करें ऑटोट्रेसहोल्ड | सभी की कोशिश करो।
   2. एक बाइनरी थ्रेसहोल्ड परिणाम छवि सभी अलग-अलग ऑटो-थ्रेसहोल्ड एल्गोरिदम के साथ दिखाई देगी, छवियों के लिए सबसे उपयुक्त एल्गोरिदम निर्धारित करती है।
      1. बाद में मैक्रो चलाते समय, तदनुसार मैक्रो सेटिंग्स में सीमा बदलें।
      2. एनएमजेक कंकाल का निर्धारण करने के लिए एनएमजे कंकाल और "हुआंग" को सक्रिय क्षेत्र निर्धारित करने के लिए "ली" जैसी सीमा और अधिक स्वतंत्र थ्रेसहोल्ड जैसे "रेनीएनट्रॉफी" या "मोमेंट्स" जैसे अधिक प्रतिबंधात्मक थ्रेसहोल्ड का उपयोग करें। जब छवियों को कोई पृष्ठभूमि के लिए थोड़ा के साथ बहुत तेज कर रहे हैं, "हुआंग" के रूप में उपयोग करें "NMJ रूपरेखा दहलीज । अन्यथा इमेज सेगमेंटेशन के बाद सिनेप्स के कुछ हिस्से गायब हो सकते हैं।
      3. एक उदाहरण के लिए चित्रा 2बी देखें। सिनैप्स का उचित विभाजन हरे बक्से द्वारा हाइलाइट किए गए ऑटो-थ्रेसहोल्ड के साथ प्राप्त किया जाता है। गैर-उपयुक्त थ्रेसहोल्ड के कुछ उदाहरणों को लाल बक्से (उच्च आवर्धन पर सिनेप्स की जांच) द्वारा हाइलाइट किया जाता है। उत्तरार्द्ध में, सिनेप्स के या तो हिस्से गायब हैं या पृष्ठभूमि के कुछ हिस्से शामिल हैं।
4. छोटे कणों का अधिकतम आकार निर्धारित करें
   नोट: यह फ़ंक्शन एनएमजे रूपरेखा सीमा और कंकाल सीमा द्वारा पता लगाया गया सभी कणों को बाहर करेगा जो विश्लेषण से "छोटे कण सेटिंग" में परिभाषित मूल्य से छोटे हैं। यह मान पिक्सल में परिभाषित किया गया है। यह फ़ंक्शन एक शोर फ़िल्टर के रूप में कार्य करता है और बहुत उपयोगी है जब प्राप्त छवियों में गैर-समान पृष्ठभूमि (जैसे क्रिस्टल/धूल) की उच्च दरें मौजूद होती हैं।
   1. चरण 6.2.6 में सहेजे गए जेड-अनुमानों को खोलें। और विश्लेषण | के माध्यम से पिक्सेल की संख्या का पता लगाने के लिए पैमाने सेट स्केल सेट करें। निम्नलिखित सेटिंग्स लागू करें: पिक्सल = 1 में दूरी, ज्ञात दूरी = 1, पिक्सेल पहलू अनुपात = 1, लंबाई की इकाई = पिक्सेल और प्रेस "ठीक है"। टूलबार में "ओवल चयन" उपकरण पर क्लिक करें।
   2. माउस का उपयोग करना एक चयन को बारीकी से आसपास के एकल कणों को आकर्षित करता है जो इम्यूनोस्टेपिंग में मौजूद हैं लेकिन एनएमजे से संबंधित नहीं हैं। मैक उपयोगकर्ताओं के लिए विंडोज उपयोगकर्ता या सीएमडी + मीटर के लिए सीटीआरएल + एम दबाएँ। एक परिणाम विंडो खुलेगी, जो पिक्सल की संख्या में चयनित कणों के क्षेत्र का संकेत देती है।
   3. सबसे बड़ा दूषित कण/विरूपण साक्ष्य क्षेत्र निर्धारित करने के लिए छवियों में मौजूद कई कलाकृतियों के साथ पिछले कदम कई बार दोहराएं । बाद में मैक्रो चलाते समय सेटिंग में सेट करने का यह मूल्य होगा। मैक्रो चलाते समय "छोटे कणों का आकार" सेट करें क्योंकि सबसे छोटे कण आकार ने मवाद को 25% का मार्जिन देखा।
   4. एक उदाहरण के लिए चित्रा 2डी देखें। सबसे बड़ा क्रिस्टल का पता चला ११२ पिक्सल का क्षेत्र है । मैक्रो के साथ इस छवि को संसाधित करते समय "छोटे कणों का आकार" सेटिंग, 125 - 150 में सेट किया जाना चाहिए।
5. न्यूनतम bouton आकार निर्धारित करें
   नोट: यह फ़ंक्शन एनएमजे रूपरेखा सीमा द्वारा पाए गए सभी बौने को बाहर कर देगा जो विश्लेषण से परिभाषित मूल्य से छोटे हैं। यह मान पिक्सल में परिभाषित किया गया है।
   1. धारा 6.4 में वर्णित समान चरणों का पालन करें, लेकिन इस मामले में एनएमजे टर्मिनल में मौजूद सबसे छोटे बाउट्स के आसपास चयन आकर्षित करते हैं। मापा लोगों की सबसे छोटी मुक्केबाज़ी के लिए इसी सबसे छोटा क्षेत्र चुनें। बाद में मैक्रो चलाते समय न्यूनतम बाउटन आकार सेटिंग में सेट करने का यह मूल्य है।
6. परिभाषित "Maxima शोर सहिष्णुता" मूल्य
   1. मैक्रो के लिए "मैक्सिमा शोर सहिष्णुता का पता लगाएं" मूल्य को परिभाषित करने के लिए, चैनल 2 जेड-स्टैक धारा 6.2.2 में सहेजा खोलें।
   2. पॉपअप मेनू में प्लगइन्स टैब पर जाएं, प्रक्रिया | का चयन करें अधिकतम (3D), और जब maximum_image_name दिखाई देती है (जो कुछ मिनट लग सकते हैं), मूल छवि स्टैक को बंद करें।
   3. Maximum..._image_name (नए प्राप्त छवि स्टैक) का चयन करें और | प्लगइन्स का चयन करें प्रक्रिया | न्यूनतम (3 डी), जब Maximum..._image_name की नई छवि न्यूनतम अधिकतम बंद हो जाती है ... _image_name स्टैक।
   4. टूलबार में, प्रक्रिया | का चयन करें मैक्सिमा का पता लगाएं.... एक नई खिड़की "मैक्सिमा का पता लगाएं..." खुलेगा। चेकबॉक्स "पूर्वावलोकन बिंदु चयन..." और डिफ़ॉल्ट मैक्रो सेटिंग 50 के साथ "शोर सहिष्णुता" बॉक्स भरें। मैक्सिमा अंक छवि में थोड़ा पार के रूप में संकेत दिया जाएगा ।
      1. एनोटेटेड सक्रिय क्षेत्रों की अधिकता देख रहे हैं, यानी पार है कि सक्रिय क्षेत्रों है कि चयनित स्टैक विमान, या पृष्ठभूमि में पता चला रहे है पर ध्यान केंद्रित नहीं कर रहे है के शीर्ष पर नहीं कर रहे है देख "शोर सहिष्णुता" मूल्य में वृद्धि ।
         1. दूसरी ओर, यदि अधूरे रूप से एनोटेटेड सक्रिय क्षेत्रों को देख रहे हैं, यानी ध्यान में सक्रिय क्षेत्रों को मान्यता नहीं दी जा रही है, तो "मैक्सिमा शोर सहिष्णुता" मूल्य को कम करें। इस प्रक्रिया का पालन करते हुए विभिन्न मूल्यों की कोशिश करते रहें जब तक कि क्रॉस उचित रूप से सक्रिय क्षेत्रों को ध्यान में रख रहे हैं। इस मूल्य के साथ "मैक्सिमा शोर सहिष्णुता का पता लगाएं" भरें।
         2. एक उदाहरण के लिए चित्रा 2सी देखें। बहुत सारे सक्रिय क्षेत्रों का पता लगाया जाता है। चित्रा 2सी में "मैक्सिमा शोर सहिष्णुता" मूल्य में वृद्धि करते समय फोकस में केवल सक्रिय क्षेत्रों का पता लगाया जाता है।
   5. चरण 5.1 में चयनित प्रतिनिधि छवियों के लिए उप-मैक्रो "विश्लेषण" चलाएं, जिसमें पिछले सभी चरणों में परिभाषित सेटिंग्स हैं।
7. बीआरपी-विरामा कम और ऊपरी सीमा को समायोजित करें
   1. ध्यान दें कि एक नई फाइल चरण 6.6 के अनुसार मैक्रो चलाने के बाद दिखाई देगी, जिसे 2_active_zone_stack_image_name कहा जाता है। इस छवि में "फाइंड मैक्सिमा" फ़ंक्शन द्वारा पता लगाया गया सक्रिय क्षेत्र प्रत्येक विमान में सफेद डॉट्स द्वारा इंगित किए जाते हैं।
   2. इस फाइल को टूलबार में खींचकर और गिराकर खोलें और इमेज | का चयन करें स्टैक | जेड-प्रोजेक्ट | प्रक्षेपण प्रकार = राशि स्लाइस। 2_active_zone_stack_image_name का एक प्रक्षेपण प्राप्त किया जाएगा।
   3. इमेज | का चयन करें | समायोजित करें शुरूआत। एक नई विंडो "थ्रेसहोल्ड" खुलेगी। ऊपरी बार स्लाइड एक सीमा मूल्य का चयन करने के लिए जहां, सभी वांछित foci/Brp सकारात्मक धब्बे लाल रंग में कल्पना कर रहे हैं ।
      नोट: यदि सीमा बहुत कम सेट की जाती है, तो सक्रिय क्षेत्रों की अधिकता गिनी जाएगी। यदि बहुत अधिक सेट किया जाता है, तो सक्रिय क्षेत्रों का एक अंश छूट जाएगा।
      1. एक उदाहरण के लिए चित्रा 2ई देखें। जब सीमा 400 तक सेट हो जाती है, तो अधिकांश सक्रिय क्षेत्र (1 पिक्सेल फोसी के रूप में प्रतीक) विभाजन में शामिल नहीं होते हैं, क्योंकि उन्हें लाल रंग(चित्रा 2ई)में हाइलाइट नहीं किया जाता है। जब सीमा 50 के मूल्य के लिए सेट की जाती है तो सभी सक्रिय क्षेत्रों को लाल रंग(चित्रा 2ई'में हाइलाइट किया जाता है)।
   4. इस मान को न्यूनतम सीमा के रूप में परिभाषित करें. अधिकतम मूल्य पर "ऊपरी विराम सीमा" छोड़ दें।
   5. इस अनुभाग के पिछले सभी चरणों में परिभाषित सेटिंग्स के साथ प्रतिनिधि छवियों के लिए उप-मैक्रो "विश्लेषण" को फिर से चलाएं। परिणामी छवि फ़ाइलों का मूल्यांकन करें और सुनिश्चित करें कि विभाजन ठीक से किया जाता है। यदि यह मामला विभाजन त्रुटियों की प्रकृति के अनुसार सेटिंग्स को समायोजित नहीं करता है(चित्र 1, तालिका 1)।

Representative Results

चित्रा 1: अनुचित मैक्रो सेगमेंटेशन परिणामों के उदाहरण। "ड्रोसोफिला एनएमजे मॉर्फोमेट्रिक्स" या"ड्रोसोफिला एनएमजे बोटन मॉर्फोमेट्रिक्स" चलाने के बाद परिणाम छवियां। सिनैप्टिक टर्मिनल के कुछ हिस्सों को पीले रंग की रूपरेखा(ए)में शामिल नहीं किया गया है। पृष्ठभूमि के कुछ हिस्सों को पीले रंग की रूपरेखा(बी)द्वारा सिनैप्टिक टर्मिनल में शामिल किया गया है। ब्लू कंकाल लाइन सिनैप्टिक टर्मिनल(सी -डी)से परे फैली हुई है। बहुत सारे सक्रिय क्षेत्रों का पता लगाया जाताहै (ई-ई')। कुछ सक्रिय क्षेत्र विश्लेषण(जी-जी)द्वारा पता नहीं चल रहे हैं। सिनेप्से(एफ)के बाहर सक्रिय क्षेत्रों का पता लगाया जाता है। गलत बौपर विभाजन (ड्रोसोफिला एनएमजे बोटन मॉर्फोमेट्रिक्स चलाते समय केवल लागू होता है), बोटॉन(एच)या बहुत सारे बौनेवों को विभाजन(I)द्वारा पता लगाया जाता है। कण ऐसे क्रिस्टल या धूल जो पृष्ठभूमि का हिस्सा हैं, विभाजन(जे)में शामिल हैं। इन त्रुटियों से बचने के लिए सेटिंग्स को बदलने की जानकारी तालिका 1में प्रदान की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्र 2: मैक्रो-सेटिंग समायोजन और छवि विभाजन के लिए उनके परिणामों के उदाहरण। (A)एक डीएलजी-1 इम्यूनोलेबल सिनेप्स का घटाव पृष्ठभूमि पूर्वावलोकन, एपोटॉम के साथ फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर इमेज किया गया है, जब "रोलिंग बॉल त्रिज्या" 20(ए)या 500(ए)के लिए सेट किया गया है। (ख)इमेज | चलाने के बाद प्राप्त आउटपुट इमेज | समायोजित करें ऑटो-थ्रेसहोल्ड | सभी छवि को 16 अलग-अलग ऑटो-थ्रेसहोल्ड एल्गोरिदम द्वारा प्राप्त छवि सेगमेंटेशन को चित्रित करता है। (ग)50 (सी) और 500(सी)पर "शोर सहिष्णुता" स्थापित करते समय "मैक्सिमाढूंढें"पूर्वावलोकन; विभाजन द्वारा पता लगाया जाता है कि सक्रिय क्षेत्र एक छोटे से पार द्वारा लेबल कर रहे हैं। (घ)एंटी-एचआरपी के साथ सिनेप्स इम्यूनोलबेल्ड की छवि पृष्ठभूमि में दिखाई देने वाले "छोटे कणों" का मापन, एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर चित्रित। (ई)"राशि स्लाइस" 2_active_zone_stack_ima-ge_name से प्राप्त प्रक्षेपण । सीमा 400(ई)और 50(ई)पर निर्धारित की गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एक खंड	देखी गई त्रुटियां	उदाहरण	आवश्यक समायोजन
एनएमजे क्षेत्र और परिधि (परिणामी छवि में पीले रंग की रूपरेखा द्वारा दर्शाया गया)	सिनैप्टिक टर्मिनल के कुछ हिस्से या तो शामिल नहीं हैं पीले रंग की रूपरेखा या पृष्ठभूमि के कुछ हिस्सों में पीले रंग में उल्लिखित सिनैप्टिक टर्मिनल में शामिल हैं।	चित्रा 2A-B	'रोलिंग बॉल रेडियस' मूल्य को समायोजित करें। धारा 6.1 देखें।	'एनएमजे रूपरेखा सीमा' को समायोजित करें। धारा 6.2 देखें।
एनएमजे लंबाई से संबंधित पैरामीटर (परिणाम छवि में नीले कंकाल लाइन द्वारा प्रतिनिधित्व)	ब्लू कंकाल लाइन या तो परे फैली हुई है या पूरे सिनैप्टिक टर्मिनल के साथ मौजूद नहीं है।	चित्रा 2C-D	'रोलिंग बॉल रेडियस' मूल्य को समायोजित करें। धारा 6.1 देखें।	'एनएमजे रूपरेखा सीमा' को समायोजित करें। धारा 6.2 देखें।
बीआरपी पॉजिटिव समय पर विराम (परिणाम छवि में डॉट्स द्वारा प्रतिनिधित्व)	बहुत सारे सक्रिय क्षेत्रों का पता लगाया जाता है।	चित्रा 2E-E '	'मैक्सिमा शोर सहिष्णुता का पता लगाएं' मूल्य कम करें। धारा 6.5 देखें।
बीआरपी पॉजिटिव समय पर विराम (परिणाम छवि में डॉट्स द्वारा प्रतिनिधित्व)	सक्रिय क्षेत्र विश्लेषण से चूक जाते हैं।	चित्रा 2G-G '	'मैक्सिमा शोर सहिष्णुता का पता लगाएं' मूल्य बढ़ाएं। धारा 6.5 देखें।	'बीआरपी-विरामा कम सीमा' को कम करें। धारा 6.6 देखें।
बीआरपी पॉजिटिव समय पर विराम (परिणाम छवि में डॉट्स द्वारा प्रतिनिधित्व)	सक्रिय क्षेत्र कलाकृतियों का पता लगाया जाता है सिनैप्टिक टर्मिनल के बाहर।	चित्रा 2F	'एक्टिव ज़ोन थ्रेसहोल्ड' धारा 6.2 को समायोजित करें.	'बीआरपी-विरामा कम सीमा' बढ़ाएं। धारा 6.6 देखें।
छोटे कण	कण ऐसे क्रिस्टल या धूल जो हिस्सा हैं पृष्ठभूमि में शामिल होने के लिए दिखाई देते हैं विभाजन।	चित्रा 2J	बॉक्स 'छोटे कणों को हटाएं' का चयन करें। धारा 6.3 देखें।	छोटे कणों का अधिकतम आकार निर्धारित करें। धारा 6.3 देखें।
बोटन सेगमेंटेशन	गलत मुक्केबाज़ी विभाजन (केवल ड्रोसोफिला एनएमजे बोटन मॉर्फोमेट्रिक्स पर लागू होता है; बोटन सेगमेंटेशन के लिए ड्रोसोफिला एनएमजे मॉर्फोमेट्रिक्स का उपयोग न करें)।	चित्रा 2H-I	'एनएमजे रूपरेखा सीमा' को समायोजित करें। धारा 6.1 देखें।	'न्यूनतम bouton आकार' निर्धारित करें। धारा 6.4 देखें।

तालिका 1: छवि विभाजन में विभिन्न प्रकार की त्रुटियों के लिए समस्या निवारण गाइड जिसे मैक्रो द्वारा उत्पादित किया जा सकता है। यह तालिका मैक्रो द्वारा उत्पादित विभिन्न प्रकार की छवि विभाजन त्रुटियों का वर्णन करती है। ये आसानी से परिणाम छवियों में पता लगाया जा सकता है। प्रत्येक त्रुटि प्रकार के उदाहरण चित्र 1में दिखाए गए हैं । तालिका के "समायोजन अनुभाग" में, जिन सेटिंग्स को समायोजित करने की आवश्यकता होती है, उन्हें हाइलाइट किया जाता है, और उपयोगकर्ता को सेक्शन 6 के महत्वपूर्ण उप-चरण में संदर्भित किया जाता है, जो इन सेटिंग्स को समायोजित करने का तरीका बताता है।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining			Dilution
Mouse anti-discs large 1	Developmental Studies Hybridoma Bank	AFFN-DLG1-4D6	1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Rabbit anti-horseradish peroxidase	Jackson IR	323-005-021	1/500
Rabbit anti-Synaptotagmin	Gift from Hugo Bellen		Jan-00
Mouse anti-Cysteine string protein	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCSP-1(ab49)	1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Mouse anti-Bruchpilot	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Jan-50
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Life technologies	A11029	1/200
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568	Life technologies	A11011	1/500
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit	ThermoFisher	Z25006
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36930
Equipment
Confocal microscope or fluorescence microscope	Leica SP5
Zeiss Axio imager
Computer	Mac or Pc
Software
FIJI