드로소필라 신경 근육 정션 (NMJ) 정량화: 시냅스 형태와 기능을 평가하는 방법

Overview

Drosophila 신경 근육 접합 (NMJ) 시 냅 스의 형태와 기능을 연구 하는 모델로 사용 됩니다. 이 비디오는 연구원이 NMJ의 특성화를 정량화하는 중요한 특징을 설명합니다. 예제 프로토콜은 정량화를 자동으로 수행할 수 있는 소프트웨어를 보여 줍니다.

Protocol

이 프로토콜은 Castells-Nobau 등에서발췌한 것으로, Drosophila N유로근육 정션 형태학의 고처리량 및 다중 파라메트릭 정량화를 위한 두 가지 알고리즘, J. Vis. Exp. (2017).

1. 이미지 처리 전에 요구 사항

1. 이전에 설명한 대로 세 번째 인스타 방황 애벌레(L3)의 드로소필라 오픈 북 준비를 수행하십시오.
2. "Drosophila NMJ Morphometrics"와 분석을 위해 Brp와 함께 Dlg-1 또는 Hrp, 그리고"Drosophila NMJ 부톤 모포메트릭"으로 분석을 위한 Syt 또는 Csp의 두 마커의 조합을 사용하여 공동 면역 라벨 Drosophila NMJ 단자.
   참고: 같은 종으로부터의 항체는 제논 알렉사 라벨링 키트와 같은 항체-컨쥬게이션 키트를 사전 라벨링하여 결합될 수 있다.
3. 이미지 NMJ 단자는 선택의 현미경, 예를 들어 형광 (아포토메유무) 또는 공초점 현미경 검사를 사용합니다.
   1. NMJ 단말의 2채널 이미지 스택을 획득합니다.
      1. 채널 1이 Dlg-1(또는 Hrp, Syt, Csp)으로 표지된 NMJ 단자 면역 라벨을 획득하고 Brp로 표지된 NMJ 단자 면역 라벨을 채널 2로 획득하는 방식으로 현미경 설정을 조정한다.
      2. 선택적으로 매크로와 함께 1채널 이미지(단일 항체로 면역 라벨을 붙인 시냅스)를 분석합니다. 이미지 NMJ는"Drosophila NMJ Morphometrics", 또는"Drosophila NMJ 부톤 Morphometrics"에 대한 Syt 또는 Csp와 분석을 위해 Dlg-1 또는 Hrp와 고유하게 표기.
         참고: 안티 브르프만으로 면역염색된 시냅스를 분석하는 것은 불가능합니다.
   2. 획득한 이미지를 개별 .tiff 파일로 내보냅니다. 표시된 대로 획득하지 않은 경우 매크로를 실행하기 전에 채널 순서를 반전합니다.

2. 소프트웨어 요구 사항 및 설치

1. 매크로 다운로드:"Drosophila NMJ Morphometrics" 및"Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" 다음 웹사이트에서: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1.
2. 커서를 "매크로 업데이트 1"폴더로 이동하고 나타나는 옵션 "보기"를 클릭합니다. 이 폴더의 내용이 있는 목록이 나타납니다. 폴더에는 매크로"Drosophila NMJ Morphometrics"와"Drosophila NMJ 부톤 모포메트릭"이 포함되어 있습니다.
   참고: 두 매크로모두 피지 버전 1.4와 호환되며 동일한 폴더에도 제공됩니다. 매크로는 최근 버전에서 실행되지 않을 수 있습니다. 제공된 버전 1.4를 사용하십시오. 그것은이 버전을 시작 하는 문제가, 심지어 더 최근 피지 버전 사용 가능한 컴퓨터에서.
3. "모두 다운로드"를 클릭합니다. 폴더 콘텐츠는 .zip 파일로 컴퓨터에 다운로드됩니다. 다운로드한 파일의 압축을 풀수 있습니다.
4. 드로소필라_NMJ_Morphometrics.ijm과 드로소필라_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm 파일을 Fiji.app/plugins/ 디렉토리에 복사합니다. 프로그램을 다시 시작할 때 매크로가 플러그인 드롭다운 메뉴 의 맨 아래에 나타납니다.

3. NMJ 이미지의 Z 프로젝션 및 하이퍼 스택을 만들기 위해 하위 매크로 "스택으로 변환"을 실행

1. 도구 모음에서 플러그인을 선택하여 그래픽 인터페이스를 시작하고 드롭다운 메뉴에서"Drosophila NMJ Morphometrics"를 선택합니다.
2. 매크로의 그래픽 인터페이스에서 "고유 파일 문자열" 설정을 정의합니다.
   참고: 현미경 소프트웨어는 개별 '.tiff 파일로 스택을 저장할 때 평면과 채널을 구성하기 위해 식별 서명을 사용합니다. 입력된 고유한 파일 문자열 설정은 소프트웨어가 첫 번째 채널의 첫 번째 평면에 할당한 서명을 지정해야 합니다(중요: 가장 낮은 평면 및 채널 번호를 표시해야 합니다).
3. 하위 매크로 "스택으로 변환"만 선택하고 "확인"을 클릭하고 이미지가 있는 폴더를 선택합니다. 여러 하위 폴더가 있는 주 디렉토리를 선택하면 고유한 파일 문자열 기준과 일치하는 기본 디렉터리 및 하위 폴더 내의 모든 개별 '.tiff 파일이 처리됩니다.
   1. z 스택에 하나의 채널만 포함되어 있는 경우 "채널 1만"이라는 상자를 선택합니다.
4. 기본적으로 nMJ 이미지당 두 개의 새 파일이 stack_image_name flatstack_image_name 나타납니다. 추가 분석을 위해 이러한 스택과 플랫스택만 저장합니다. 이 시점에서 .tiff 파일 계열을 삭제하여 필요한 저장소 용량을 최소화하고 잠재적인 오류 원본을 피할 수 있습니다.

4. NMJ 단말기를 규명하기 위해 하위 매크로 "ROI 정의" 실행

1. "Drosophila NMJ Morphometrics"의 그래픽 인터페이스를 시작합니다.
2. "ROI 정의"만 확인란을 선택하고 "OK"를 누르고 flatstack_name 이미지가 저장되어 있는 메인 디렉토리를 선택하고 "선택"을 누릅니다. 하위 매크로 "ROI 정의"는 선택한 주 디렉터리 내의 모든 하위 폴더를 자동으로 검색합니다.
3. 첫 번째 투영이 열리면 도구 모음에서 "Freehand 선택" 도구를 선택합니다.
4. 마우스를 사용하여 관심있는 전체 NMJ 단말이 독점적으로 포함 된 선택을 그리고 창 "터미널 정의"에서 "OK"를 클릭합니다. 매크로는 다음 프로젝션으로 진행됩니다.
5. 다음 ROI를 설명하고 모든 ROI가 정의될 때까지 반복합니다. "roi_image_name"라는 ROI 이미지 파일은 처리된 각 이미지에 대해 이전에 생성된 스택 및 프로젝션 이미지와 동일한 디렉터리에 저장됩니다. 이 하위 매크로의 출력은 검은색 배경에 흰색으로 ROI의 이진 이미지입니다.

5. NMJ 단자 기능을 정량화하기 위해 하위 매크로 "분석"을 실행

1. 도구 모음으로 이동하여 "플러그인"을 선택하고 다음을 사용하십시오.
   "드로소필라_NMJ_Morphometrics"은 반-드그-1 또는 안티-Hrp(채널 1)로 표기된 시냅스를 반브르프(채널 2)와 함께 분석할 때, 또는"드로소필라_NMJ_Bouton_Morphometrics"을 분석할 때, Brp(채널 2)와 함께 안티 시프 또는 항-Csp(채널 1)으로 면역라벨을 부착한 시냅스를 분석할 때.
   1. 하나의 채널 이미지 스택을 분석해야 할 때("Drosophila_NMJ_Morphometrics"에 대한 구조 채널 Dlg-1 또는 HRP, 또는"drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics"에 대한 Syt 또는 Csp)를 선택하면 상자 "채널 1만"을 선택합니다.
2. 분석할 이미지에 해당하는 배율을 조정합니다.
   1. 이미지의 한 픽셀이 2.5 μm에 해당하는 경우 크기 조정 픽셀 = 1, μm의 스케일 거리 = 2.5를 나타냅니다. 두 설정이 0에 남아 있는 경우 NMJ 영역, 둘레, 길이 및 가장 긴 분기 길이가 픽셀 수로 표시됩니다.
3. 필요한 경우 매크로의 기본 분석 설정을 조정합니다. 하위 매크로 "분석"이 이전에 만족스럽지 못한 결과로 실행된 경우에만 조정을 수행합니다(이 섹션의 끝 및 설정을 최적화하는 방법에 대한 섹션 6 참조).
4. "분석"과 "대기"와 "확인"을 누르고 "확인"을 누릅니다.
   1. 2채널 이미지에서 하위 매크로 "분석" "분석"을 실행할 때 "대기" 확인란을 선택합니다. 그렇지 않으면 제한된 컴퓨터 용량으로 인해 활성 영역 계산의 오류가 발생할 수 있습니다.
5. 새 창 "디렉터리 선택"이 열리면 이미지가 있는 디렉토리를 선택하고 "선택"을 누릅니다. 매크로는 주 디렉토리에 저장된 모든 이미지를 분석하고 해당되는 경우 후속 폴더(이전 하위 매크로를 실행하지 않는 세 개의 파일을 사용) stack_image_name, flatstack_image_name 및 roi_image_name). 매크로는 각 이미지를 개별적으로 연속적으로 처리합니다. 이 문제는 이미지 스택당 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다(컴퓨터 용량에 따라 다름).
6. 매크로를 실행한 후 저장된 각 시냅스에 대해 res_image_name 라는 새 이미지 파일이 부모 폴더에 생성됩니다. 정량적 측정은 "결과.txt" 파일로 저장됩니다.
7. 모든 결과 이미지를 검사하여 세분화 오류가 있는 사진을 감지하고 제외합니다. 가능한 세분화 오류는 표 1에설명되어 있으며 이러한 오류를 우회하기 위해 설정을 조정하는 방법에 대한 조언이 있습니다. 이러한 세분화 오류가 있는 결과 이미지는 그림 1의예로 제공됩니다.
   참고: 사용자 인터페이스에서 관찰된 기본 설정으로 매크로를 실행할 때 매크로 평가가 수동 평가와 비교되었을 때 약 95%의 정확도가 있었습니다.

6. 매크로 설정을 이미지로 조정

1. 이미지의 5% 이상이 세분화 오류를 표시하면 다양한 알고리즘을 탐색하여 이미지에 가장 적합한 매크로 설정을 정의/선택합니다.
2. 롤링 볼 반경 값 조정
   참고: 롤링 볼 반지름 함수는 이미지의 배경을 뺍니다. 이 기능은 형광 현미경 및/또는 이미지가 배경 소음이 높은 경우 획득 한 이미지로 작업 할 때 매우 중요합니다. 배경의 빼기는 매크로의 자동 임계값 단계로 NMJ 단자의 적절한 세분화를 생성하는 데 도움이 됩니다.
   1. 하위 매크로 "스택으로 변환"에 의해 생성 된 세 개의 NMJ stack_image_name 이미지를 선택합니다. 이미지 데이터 집합을 대표하는 이미지를 선택합니다.
   2. 도구 모음에서 이미지 | 선택 색상 | 채널을 분할합니다. 두 개의 이미지 스택이 만들어지며, 하나는 각각 채널 1과 다른 채널 2를 나타내고 저장합니다.
   3. Dlg-1, Hrp, Syt 또는 Csp 면역 라벨링에 해당하는 채널 1 오픈에 속하는 이미지 스택을 엽니다.
   4. 도구 모음에서 "프로세스"를 선택한 다음 "배경 빼기"를 선택하여 필터 "배경 빼기"를 실행하십시오. 드롭다운 메뉴에서.
   5. 팝업 창의 미리 보기 확인란을 클릭하고 롤링 볼 반경을 이미지에 가장 적합한 값으로 조정합니다. "롤링 볼 반지름" 설정은 시냅스와 배경 사이의 대비를 높이는 값으로 조정되어야 합니다(그림 2A 참조).
      1. 예를 들어 그림 2를 참조하십시오. 패널 A에서 시냅스의 일부가 배경과 동일한 회색 레벨을 표시하는 반면 그림 2 패널 A에서는 500의 "롤링 볼 반경"이 시냅스와 배경 사이의 강한 대비를 이룹니다.
   6. 도구 모음 이미지 | 선택하여 z 프로젝션 만들기 스택| Z 프로젝션, 프로젝션 유형 = 최대 강도를 선택하고 결과 이미지를 저장합니다. 롤링 볼 반지름에 적합한 값이 정의되면 롤링 볼 반지름 값이 동일한 나머지 대표 이미지에서 "배경 빼기" 알고리즘을 실행합니다. Z 프로젝션을 만들고 저장합니다(모든 디렉토리).
      참고: 8비트 또는 RGB 이미지의 롤링 볼 반지름 값은 배경의 일부가 아닌 이미지에서 가장 큰 오브젝트의 반지름만큼 커야 합니다. 16비트 및 32비트 이미지의 경우 반지름은 픽셀 값 범위에 반비례해야 합니다.
3. 사용될 다른 자동 임계값 결정
   1. 이전 단계(6.2.6)에 저장된 Z 프로젝션을 열고 이미지 선택 | 조정 | 자동 임계값 | 모두 시도하십시오.
   2. 이진 임계값이 다른 결과 이미지가 모든 다른 자동 임계값 알고리즘과 함께 나타나므로 이미지에 가장 적합한 알고리즘을 결정합니다.
      1. 나중에 매크로를 실행할 때 매크로 설정의 임계값을 변경합니다.
      2. NMJ 개요 임계값으로 "RenyiEntrophy" 또는 "모멘트"와 같은 보다 제한적인 임계값을 사용하여 NMJ 골격을 결정하기 위해 "Li"와 "Huang"과 "Huang"과 같은 더 관대한 임계값을 사용하여 활성 영역을 결정합니다. 이미지가 배경이 거의 또는 전혀 없는 매우 선명한 경우 NMJ 개요 임계값으로 "황"을 사용합니다. 그렇지 않으면 이미지 세분화 후 시냅스의 일부가 누락될 수 있습니다.
      3. 예를 들어 그림 2B를 참조하십시오. 시냅스의 적절한 세분화는 녹색 상자에 의해 강조 표시된 자동 임계값으로 가져옵니다. 적합하지 않은 임계값의 몇 가지 예는 빨간색 상자(높은 배율에서 시냅스를 확인함)로 강조 표시됩니다. 후자의 경우 시냅스의 일부가 누락되거나 배경의 일부가 포함됩니다.
4. 작은 파티클의 최대 크기 결정
   참고: 이 함수는 NMJ 윤곽선 임계값 및 해석에서 "작은 입자 설정"에서 정의된 값보다 작은 골격 임계값에 의해 감지된 모든 입자를 제외합니다. 이 값은 픽셀단위로 정의됩니다. 이 기능은 노이즈 필터역할을 하며, 얻어진 이미지에 균일하지 않은 배경(예: 크리스탈/먼지)의 높은 비율이 존재할 때 매우 유용합니다.
   1. 6.2.6 단계에서 저장된 Z 프로젝션을 엽니다. 분석 | 통해 픽셀 수를 감지하도록 스케일을 설정합니다. 배율 설정. 다음 설정을 적용: 픽셀의 거리 = 1, 알려진 거리 = 1, 픽셀 종횡비 = 1, 길이의 단위 = 픽셀 및 "확인"을 누릅니다. 도구 모음의 "타원형 선택" 도구를 클릭합니다.
   2. 마우스를 사용하여 면역스테인링에 존재하지만 NMJ에 속하지 않는 단일 입자를 밀접하게 둘러싼 선택을 그립니다. Mac 사용자를 위해 Ctrl+m을 누르거나 Mac 사용자를 위해 cmd+m을 누릅니다. 결과 창이 열리면 픽셀 수로 선택한 파티클의 영역을 나타냅니다.
   3. 이미지에 여러 아티팩트가 있는 이전 단계를 여러 번 반복하여 가장 큰 오염 입자/아티팩트 영역을 결정합니다. 나중에 매크로를 실행할 때 설정에서 설정하는 값이 됩니다. 매크로를 실행할 때 "작은 입자 크기"를 가장 작은 입자 크기로 설정하여 관찰된 가장 작은 입자 크기로 고름의 여백을 25%로 관찰합니다.
   4. 예를 들어 그림 2D를 참조하십시오. 검출된 가장 큰 결정은 112픽셀의 면적을 가지고 있습니다. 매크로로 이 이미지를 처리할 때 "작은 파티클 크기" 설정은 125 - 150으로 설정해야 합니다.
5. 최소 부튼 크기 결정
   참고: 이 함수는 분석에서 정의된 값보다 작은 NMJ 개요 임계값에서 감지된 모든 boutons를 제외합니다. 이 값은 픽셀단위로 정의됩니다.
   1. 섹션 6.4에 설명된 것과 동일한 단계를 따르지만,이 경우 NMJ 단결에 존재하는 가장 작은 부폰을 둘러싼 선택을 그립니다. 측정된 영역의 가장 작은 부폰에 해당하는 가장 작은 영역을 선택합니다. 나중에 매크로를 실행할 때 최소 bouton 크기 설정으로 설정하는 값입니다.
6. "막시마 노이즈 허용 오차" 값 정의
   1. 매크로에 대한 "최대음 공차 찾기" 값을 정의하려면 섹션 6.2.2에 저장된 채널 2 Z 스택을 엽니다.
   2. 팝업 메뉴의 플러그인 탭으로 이동하여 프로세스 | 선택합니다. 최대(3D) 및 maximum_image_name 나타나면(몇 분 정도 걸릴 수 있음) 원본 이미지 스택을 닫습니다.
   3. Maximum..._image_name(새로 얻은 이미지 스택)을 선택하고 플러그인 | 선택 프로세스 | 최소(3D) 새 이미지 최소 Maximum..._image_name 최대치가 닫히면 _image_name 스택이 있습니다.
   4. 도구 모음에서 프로세스 | 선택 최대맥 찾기.... 새로운 창 "최대마 찾기..." 열립니다. 확인란 "미리 보기 포인트 선택..." 확인란을 클릭합니다. 기본 매크로 설정 50으로 "노이즈 공차" 상자를 채웁니다. 최대값은 이미지에 작은 십자가로 표시됩니다.
      1. "노이즈 공차" 값을 늘리면,이 에 의해 선택된 스택 평면에 초점을 맞추지 않은 활성 영역 위에 없는 십자가 또는 백그라운드에서 감지되는 거짓 활성 영역을 관찰합니다.
         1. 한편, 불완전한 음부가 있는 활성 영역, 즉 초점 영역을 인식하지 못하는 경우 "Maxima 잡음 허용 오차" 값을 줄입니다. 십자가가 적절하게 초점에 활성 영역을 레이블이 될 때까지이 절차에 따라 다른 값을 시도 계속합니다. 이 값으로 "최대 음수 공차 찾기"를 채웁니다.
         2. 예를 들어 그림 2C를 참조하십시오. 너무 많은 활성 영역이 감지됩니다. 도 2C에서 "Maxima 잡음 허용 오차" 값을 높일 때 초점영역만 감지됩니다.
   5. 5.1 단계에서 선택한 대표 이미지에 대해 하위 매크로 "분석"을 실행하고 이전 모든 단계에 정의된 설정을 실행합니다.
7. Brp-puncta 하부 및 상부 임계값 조정
   1. 2_active_zone_stack_image_name 라는 단계 6.6에 따라 매크로를 실행한 후 새 파일이 나타납니다. 이 이미지 스택에서 "최대마 찾기" 함수에서 감지된 활성 영역은 각 평면의 흰색 점으로 표시됩니다.
   2. 도구 모음에 드래그앤드롭하여 이 파일을 열고 이미지 | 스택 | Z 프로젝트 | 투영 유형 = 합계 슬라이스입니다. 2_active_zone_stack_image_name 투영이 얻어질 것이다.
   3. 이미지 | 선택 조정 | 문지방. 새 창 "임계값"이 열립니다. 위쪽 막대를 밀어 원하는 모든 포시/Brp 양성 반점이 빨간색으로 시각화되는 임계값값을 선택합니다.
      참고: 임계값이 너무 낮게 설정되면 활성 영역의 초과가 계산됩니다. 너무 높게 설정하면 활성 영역의 일부가 누락됩니다.
      1. 예를 들어 그림 2E를 참조하십시오. 임계값이 400으로 설정되면 대부분의 활성 영역(1 픽셀 포시로 기호)은 빨간색으로 강조표시되지 않으므로 세분화에 포함되지않습니다(그림 2E). 임계값이 50값으로 설정되면 모든 활성 영역이 빨간색으로 강조표시됩니다(그림 2E').
   4. 이 값을 최소 임계값으로 정의합니다. 최대 값에 "상부 말크타 임계값"을 둡니다.
   5. 이 섹션의 모든 이전 단계에 정의된 설정으로 대표 이미지에 대한 하위 매크로 "분석"을 다시 실행합니다. 결과 이미지 파일을 비판적으로 평가하고 세분화가 제대로 수행되었는지 확인합니다. 이 경우 분할 오류의 특성에 따라 설정을 재조정합니다(그림1, 표 1).

Representative Results

그림 1: 부적절한 매크로 세분화 결과의 예입니다. "Drosophila NMJ Morphometrics" 또는"Drosophila NMJ 부톤 모포메트릭"을 실행 한 후 결과 이미지. 시냅스 단말의 일부는 노란색윤곽선(A)에포함되지 않습니다. 배경의 일부는 노란색윤곽선(B)에의해 시냅스 단자안에 포함된다. 파란색 골격 선은 시냅스단자(C- D)를넘어 확장됩니다. 너무 많은 활성 영역이 감지됩니다(E- E'). 일부 활성 영역은 분석(G- G')에의해 발견되지 않은 상태로 유지됩니다. 활성 영역은 시냅스(F)외부에서 검출된다. 잘못된 부톤 세분화 (Drosophila NMJ 부튼 모포메트릭을 실행할 때만 적용 가능), 부톤이 누락(H)또는 너무 많은 부톤은 세분화에 의해 감지됩니다(I). 배경의 일부인 결정이나 먼지와 같은 입자는세분화(J)에포함된다. 이러한 오류를 방지하기 위해 설정을 변경하는 방법에 대한 정보는 표 1에제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 매크로 설정 조정 및 이미지 세분화에 대한 결과의 예입니다. (A)"롤링 볼 반경"이 20(A)또는 500(A)로설정될 때, ApoTome와 형광 현미경에 이미지 Dlg-1 면역 라벨 시냅스의 배경 미리보기를 뺍니다. (B)이미지 | 실행 한 후 얻은 출력 이미지 조정 | 자동 임계값 | 모든 이미지를 사용하여 16개의 서로 다른 자동 임계값 알고리즘에서 얻은 이미지 세분화를 보여 줍니다. (C)50(C)및 500(C'에서"소음 허용 오차"를 설정할 때 "막시마 찾기" 미리보기); 분할에 의해 감지되는 활성 영역은 작은 십자가에 의해 레이블이 지정됩니다. (D)공초점 현미경상에서 이미지화된 반Hrp로 표기된 시냅스의 이미지 배경에 나타나는 "작은 입자"의 측정. (E)2_active_zone_stack_ima-ge_name 얻은 "합계 슬라이스" 투영. 임계값은 400(E)및 50(E')로설정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

세분화	관찰된 오류	본보기	필요한 조정
NMJ 영역 및 둘레 (결과 이미지의 노란색 윤곽선으로 표시)	시냅스 터미널의 일부가 포함되지 않습니다. 노란색 윤곽선 또는 배경의 일부 노란색으로 윤곽을 비기는 시냅스 단자안에 포함되어 있습니다.	그림 2A-B	'롤링 볼 반경' 값을 조정합니다. 섹션 6.1을 참조하십시오.	'NMJ 개요 임계값'을 조정합니다. 섹션 6.2를 참조하십시오.
NMJ 길이 관련 매개 변수 (결과 이미지에서 파란색 골격 선으로 표시)	블루 스켈레톤 선은 넘어또는 전체 시냅스 터미널을 따라 존재하지 않습니다.	그림 2C-D	'롤링 볼 반경' 값을 조정합니다. 섹션 6.1을 참조하십시오.	'NMJ 개요 임계값'을 조정합니다. 섹션 6.2를 참조하십시오.
브르프 양성 말장난 (결과 이미지의 점으로 표현)	너무 많은 활성 영역이 감지됩니다.	그림 2E-E'	'최대 소음 허용 오차 찾기' 값을 줄입니다. 섹션 6.5를 참조하십시오.
브르프 양성 말장난 (결과 이미지의 점으로 표현)	분석에 의해 활성 영역이 누락됩니다.	그림 2G-G'	'최대 소음 허용 오차 찾기' 값을 늘립니다. 섹션 6.5를 참조하십시오.	'브롭-펀크타 하부 임계값'을 줄입니다. 섹션 6.6을 참조하십시오.
브르프 양성 말장난 (결과 이미지의 점으로 표현)	활성 영역 아티팩트가 감지됩니다. 시냅스 터미널 외부.	그림 2층	'활성 영역 임계값' 섹션 6.2를 조정합니다.	'브롭-펀크타 하한 임계값'을 늘립니다. 섹션 6.6을 참조하십시오.
작은 입자	입자는 부분인 결정이나 먼지와 같은 입자입니다. 배경의 에 포함 된 것으로 보인다 세분화합니다.	그림 2J	'작은 파티클 제거'상자를 선택합니다. 섹션 6.3을 참조하십시오.	작은 파티클 최대 크기를 결정합니다. 섹션 6.3을 참조하십시오.
부톤 세분화	잘못된 부톤 세분화 (드로소필라 NMJ 부톤 모포메트릭에만 적용; 부톤 세분화에 드로소필라 NMJ 모포메트릭을 사용하지 마십시오.)	그림 2H-I	'NMJ 개요 임계값'을 조정합니다. 섹션 6.1을 참조하십시오.	'최소 부턴 크기'를 결정합니다. 섹션 6.4를 참조하십시오.

표 1: 매크로에서 생성할 수 있는 이미지 세분화의 다양한 종류의 오류에 대한 문제 해결 가이드입니다. 이 표는 매크로에서 생성된 다양한 종류의 이미지 세분화 오류를 설명합니다. 이러한 이미지는 결과 이미지에서 쉽게 감지할 수 있습니다. 각 오류 유형의 예는 그림 1에표시됩니다. 테이블의 "조정 섹션"에서 조정해야 하는 설정이 강조 표시되고 사용자는 이러한 설정을 조정하는 방법을 설명하는 섹션 6의 중요한 하위 단계를 참조합니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining			Dilution
Mouse anti-discs large 1	Developmental Studies Hybridoma Bank	AFFN-DLG1-4D6	1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Rabbit anti-horseradish peroxidase	Jackson IR	323-005-021	1/500
Rabbit anti-Synaptotagmin	Gift from Hugo Bellen		Jan-00
Mouse anti-Cysteine string protein	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCSP-1(ab49)	1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Mouse anti-Bruchpilot	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Jan-50
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Life technologies	A11029	1/200
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568	Life technologies	A11011	1/500
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit	ThermoFisher	Z25006
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36930
Equipment
Confocal microscope or fluorescence microscope	Leica SP5
Zeiss Axio imager
Computer	Mac or Pc
Software
FIJI