Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

Drosophila (olika betydelser) Kvantifiering av neuromuskulär korsning (NMJ): En metod för att bedöma synaptisk morfologi och funktion

Overview

Drosophila neuromuskulära korsning (NMJ) används som modell för att studera synapsernas morfologi och funktion. Den här videon beskriver viktiga funktioner som forskare kvantifierar för att karakterisera NMJ. Exempelprotokollet visar en programvara som kan utföra kvantifieringen automatiskt.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Castells-Nobau et al., Två algoritmer för hög genomströmning och multiparametrisk kvantifiering av Drosophila Neuromuskulär junction morfologi, J. Vis. Exp. (2017).

1. Krav före bildbehandling

  1. Utför Drosophila open book preparat av tredje instar vandrande larver (L3), som tidigare beskrivits.
  2. Co-immunolabel Drosophila NMJ terminaler med en kombination av två markörer: Dlg-1 eller Hrp tillsammans med Brp för analys med "Drosophila NMJ Morphometrics", och Syt eller Csp tillsammans med Brp för analys med "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics ".
    OBS: Antikroppar från samma art kan kombineras genom att märka en med ett antikroppskonjugationskit som Zenon Alexa Labeling Kits.
  3. Bild NMJ-terminaler med hjälp av ett val av mikroskop, t.ex. fluorescens (med eller utan ApoTome) eller konfokal mikroskopi.
    1. Skaffa en 2-kanalig bildstapel av NMJ-terminalen.
      1. Justera mikroskopinställningarna på ett sätt som kanal 1 förvärvar NMJ-terminalen immunolabeled med Dlg-1 (eller Hrp, Syt, Csp) och kanal 2 NMJ-terminalen immunolabeled med Brp.
      2. Du kan också analysera enkanaliga bilder (av synapser immunolabelerade med en enda antikropp) med makrona. Bild NMJs immunolabeled unikt med Dlg-1 eller Hrp för analys med "Drosophila NMJ Morphometrics", eller Syt eller Csp för "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics ".
        OBS: Det är inte möjligt att analysera synapser immunostained med endast anti-Brp.
    2. Exportera de erhållna bilderna som enskilda .tiff filer. Invertera kanalordningen innan makrona körs om de inte förvärvas enligt anvisningarna.

2. Programvarukrav och installation

  1. Ladda ner makrona: "Drosophila NMJ Morphometrics" och "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" från följande webbplats: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1.
  2. Flytta markören till mappen "Makron uppdatering 1" och klicka på det visas alternativet "visa". En lista med innehållet i den här mappen visas. Mappen innehåller makrona "Drosophila NMJ Morphometrics" och "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics ".
    OBS: Båda makrona är kompatibla med Fiji version 1.4, som också finns i samma mapp. Makrona kanske inte körs på de senaste versionerna. Använd den medföljande versionen 1.4. Det är oproblematiskt att starta den här versionen, även på datorer med en nyare Fiji-version tillgänglig.
  3. Klicka på "Ladda ner alla". Mappinnehållet hämtas till datorn som en .zip fil. Packa upp den nedladdade filen.
  4. Kopiera filerna Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm och Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm för att Fiji.app/plugins/ katalogen. När du startar om programmet visas makrona längst ned på rullgardinsmenyn Plugins.

3. Kör undermakroet "Konvertera till stack" för att skapa Z-projektioner och hyperstacks av NMJ-bilderna

  1. Starta det grafiska gränssnittet genom att välja plugins i verktygsfältet och välj "Drosophila NMJ Morphometrics " i rullgardinsmenyn.
  2. Definiera inställningen "Unik filsträng" i makrot:s grafiska gränssnitt.
    OBS: Mikroskopprogramvaran använder en identifieringssignatur för att organisera plan och kanaler när staplar lagras som enskilda .tiff filer. Den angivna unika filsträngsinställningen måste ange signaturen som tilldelas programvaran till det första planet i den första kanalen (viktigt: lägsta plan- och kanalnummer måste anges).
  3. Markera bara undermakroet "Konvertera till stapel" och klicka på "ok" och markera mappen där bilderna finns. Om en huvudkatalog med flera undermappar är markerad bearbetas alla enskilda .tiff-filer i huvudkatalogen och undermappen som matchar de unika filsträngskriterierna.
    1. Om z-stacken bara innehåller en kanal väljer du rutan "Endast kanal 1".
  4. Observera att två nya filer per NMJ-bild, som standard kallas stack_image_name och flatstack_image_name visas. Lagra endast dessa stack och flatstack för vidare analys. Den .tiff filserien kan tas bort i det här läget, vilket minimerar den nödvändiga lagringskapaciteten och undviker potentiella felkällor.

4. Kör undermakroet "Define ROI" för att avgränsa NMJ Terminal of Interest

  1. Starta det grafiska gränssnittet för "Drosophila NMJ Morphometrics ".
  2. Markera bara kryssrutan "Definiera ROI" och tryck på "OK" och välj huvudkatalogen där bilderna med titeln flatstack_name lagras och tryck på "Välj". Undermakroet "Define ROI" söker automatiskt igenom alla undermappar i den valda huvudkatalogen.
  3. När den första projektionen öppnas väljer du verktyget "Frihandsval" i verktygsfältet.
  4. Använd musen rita en markering som uteslutande innehåller den kompletta NMJ-terminalen av intresse och klicka på "OK" i fönstret "Definiera terminal". Makrot fortsätter med nästa prognos.
  5. Avgränsa nästa ROI och upprepa tills alla ROM-skivor har definierats. ROI-bildfilen, med namnet "roi_image_name", lagras i samma katalog som de tidigare genererade stack- och projektionsbilderna för var och en av de bearbetade bilderna. Utdata från detta undermakro är en binär bild av AVKASTNINGEN i vitt på en svart bakgrund.

5. Kör submakroet "Analysera" för att kvantifiera NMJ-terminalfunktioner

  1. Gå till verktygsfältet, välj "Plugins" och använd:
    "Drosophila_NMJ_Morphometrics" när man analyserar synapser immunolabeled med anti-Dlg-1 eller anti-Hrp (kanal 1) tillsammans med anti-Brp (kanal 2), eller "Drosophila_NMJ_Bouton_Morphometrics" när man analyserar synapser immunolabeled med anti-Syt eller anti-Csp (kanal 1) tillsammans med Brp (kanal 2).
    1. När en kanalbildstaplar ska analyseras (strukturkanalen Dlg-1 eller HRP för "Drosophila_NMJ_Morphometrics", eller Syt eller Csp för "Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics"), välj rutan "Endast Kanal 1".
  2. Justera skalan som motsvarar de bilder som ska analyseras.
    1. Om en pixel i bilden motsvarar 2,5 μm, ange Scale-Pixels = 1, Scale-Distance in μm = 2,5. Om båda inställningarna lämnas på 0 kommer NMJ-området, omkretsen, längden och den längsta grenlängden att uttryckas i antal pixlar.
  3. Om det behövs justerar du standardanalysinställningarna för makrot. Utför endast justeringar om undermakroet "Analysera" tidigare har körts med otillfredsställande resultat (se slutet av det här avsnittet och avsnitt 6 för instruktioner om hur du optimerar inställningarna).
  4. Markera kryssrutorna "Analysera" och "Vänta" och tryck på "OK".
    1. Markera kryssrutan "Vänta" när du kör undermakroet "Analysera" på tvåkanalsbilder. Annars kan fel i aktiv zonräkning uppstå på grund av begränsad datorkapacitet.
  5. När ett nytt fönster "Välj en katalog" öppnas väljer du katalogen där bilderna finns och trycker på "välj". Makrot analyserar alla bilder som lagras i huvudkatalogen och, i förekommande fall, efterföljande mappar (med hjälp av de tre filerna från att köra de tidigare undermakrona: stack_image_name, flatstack_image_name och roi_image_name). Makrot bearbetar varje bild individuellt och i följd. Detta kan ta flera minuter per bildstack (beroende på datorkapaciteten).
  6. När du har kört makrot bör du notera att en ny bildfil med namnet res_image_name för varje analyserad synaps som lagras skapas i föräldramappen. De kvantitativa mätningarna lagras som "resultat.txt" fil.
  7. Kontrollera alla resultatbilder för att identifiera och utesluta bilder med segmenteringsfel. Möjliga segmenteringsfel beskrivs i tabell 1, tillsammans med råd om hur du justerar inställningarna för att kringgå dessa fel. Resultatbilder med sådana segmenteringsfel ges som exempel i figur 1.
    OBS: När du körde makrot med standardinställningarna som observerades i användargränssnittet fanns det en noggrannhet på cirka 95% när makrobedömningen jämfördes med manuell utvärdering.

6. Justera makroinställningarna till bilderna

  1. När mer än 5 % av bilderna visar segmenteringsfel kan du utforska de olika algoritmerna för att definiera/välja de lämpligaste makroinställningarna för bilderna.
  2. Justera radievärde för rullande kula
    OBS: Funktionen rolling ball radius subtraherar bildens bakgrund. Denna funktion är av avgörande betydelse när man arbetar med bilder som förvärvats på fluorescensmikroskop och/eller när bilder har högt bakgrundsljud. Subtraktionen av bakgrunden kommer att hjälpa makrot att automatiskt tröskelvärde steg för att producera tillräcklig segmentering av NMJ terminaler.
    1. Välj tre NMJ-stack_image_name bilder som genereras av undermakroet "Konvertera till stack". Välj bilder som är representativa för bild datauppsättningen.
    2. Välj Bild i verktygsfältet | Färg | Delade kanaler. Två bildstaplar skapas, en som representerar kanal 1 respektive den andra kanal 2 och sparar dem.
    3. Öppna bildstacken som tillhör kanal 1 öppen, motsvarande Dlg-1, Hrp, Syt eller Csp immunolabeling.
    4. Kör filtret "Subtrahera bakgrund" genom att välja "Process" i verktygsfältet följt av "Subtrahera bakgrund..." i rullgardinsmenyn.
    5. Klicka på förhandsgransknings kryssrutan i popup-fönstret och justera radien för rullande bollar till det värde som är lämpligast för bilderna. Inställningen "Rullande kulradie" bör justeras till värden som ökar kontrasten mellan synaps och bakgrund (se figur 2A').
      1. Se figur 2 för ett exempel. I panel A visar delar av synapsen samma gråa nivåer som bakgrunden, medan en radie av "Rullande kula" på 500 i figur 2 a resulterar i stark kontrast mellan synapsen och bakgrunden.
    6. Skapa en z-projektion genom att välja bild | Stack| Z-projektion, välj Projektionstyp = Max intensitet och spara den resulterande bilden. När lämpligt värde för radien för rullande kula definieras kör du algoritmen "Subtrahera bakgrund" på de återstående representativa bilderna med samma radievärde för rullande kulor. Skapa Z-projektionerna och spara dem (i valfri katalog).
      OBS: Radievärdet för rullande kula för 8-bitars- eller RGB-bilder bör vara minst lika stort som radien för det största objektet i bilden som inte ingår i bakgrunden. För 16- och 32-bitarsbilder bör radien vara omvänt proportionell mot pixelvärdeintervallet.
  3. Bestäm de olika automatiska tröskelvärden som ska användas
    1. Öppna Z-projektionerna som sparats i föregående steg (6.2.6) och Välj | Justera | AutoThreshold | Försök med allt.
    2. Eftersom en binär trösklar resultatbild visas med alla olika algoritmer för automatisk tröskel bestämmer du den lämpligaste algoritmen för bilderna.
      1. När du kör makrot senare ändrar du tröskelvärdet i makroinställningarna i enlighet därmed.
      2. Använd mer restriktiva tröskelvärden som "RenyiEntrophy" eller "Moments" som NMJ-dispositionströskeln och mer tillåtande trösklar som "Li" för att bestämma NMJ-skelettet och "Huang" för att bestämma aktiva zoner. När bilderna är mycket skarpa med liten eller ingen bakgrund, använd "Huang" som" NMJ-dispositionströskel. Annars kan delar av synapsen saknas efter bildsegmentering.
      3. Se figur 2B till exempel. Lämplig segmentering av synapsen erhålls med automatiska tröskelvärden markerade med gröna rutor. Några exempel på icke-lämpliga tröskelvärden markeras med röda rutor (markera synapser vid hög förstoring). I den senare saknas antingen delar av synapsen eller delar av bakgrunden.
  4. Bestäm den maximala storleken på de små partiklarna
    OBS: Den här funktionen utesluter alla partiklar som detekteras av NMJ-dispositionströskeln och skeletttröskeln som är mindre än det definierade värdet i inställningen "små partiklar" från analysen. Det här värdet definieras i bildpunkter. Denna funktion fungerar som ett brusfilter och är mycket användbar när höga nivåer av ojämn bakgrund (såsom kristaller / damm) finns i de erhållna bilderna.
    1. Öppna Z-projektionerna som sparats i steg 6.2.6. och ställa in skalan för att identifiera antalet pixlar via Analysera | Ställ in skala. Använd följande inställningar: avstånd i pixlar = 1, känt avstånd = 1, pixelproportion = 1, Längdenhet = pixel och tryck på "Ok". Klicka på verktyget "Oval markering" i verktygsfältet.
    2. Med hjälp av musen rita en markering nära omgivande enstaka partiklar som finns i immunostaining men inte tillhör NMJ. Tryck på Ctrl+m för en Windows-användare eller cmd+m för Mac-användare. Ett resultatfönster öppnas, vilket anger området för de partiklar som valts i antal pixlar.
    3. Upprepa föregående steg flera gånger med flera artefakter i bilderna för att bestämma det största förorenande partikel-/artefaktområdet. Det här är det värde som ska anges i inställningen när makrot körs senare. När du kör makrot ställa in "Small Particles Size" som den minsta observerade partikelstorleken var en marginal på 25%.
    4. Se figur 2D för ett exempel. Den största kristallen som detekteras har ett område på 112 pixlar. Inställningen "Små partiklar storlek", när du bearbetar den här bilden med makrot, bör ställas in på 125 - 150.
  5. Bestäm minsta boutonstorlek
    OBS: Den här funktionen utesluter alla boutons som identifieras av NMJ-dispositionströskeln som är mindre än det definierade värdet från analysen. Det här värdet definieras i bildpunkter.
    1. Följ samma steg som beskrivs i avsnitt 6.4, men rita i detta fall ett urval kring de minsta boutons som finns i NMJ-terminalen. Välj det minsta området som motsvarar den minsta boutonen av de uppmätta. Det här är det värde som ska anges i inställningen för minsta boutonstorlek när makrot körs senare.
  6. Definiera värdet "Maxima brustolerans"
    1. Om du vill definiera värdet "Hitta maxima brustolerans" för makrot öppnar du kanal 2 Z-stacken som sparats i avsnitt 6.2.2.
    2. Gå till fliken plugins i popup-menyn, välj Process | Maximum(3D) och när maximum_image_name visas (vilket kan ta några minuter) stänger du den ursprungliga bildstacken.
    3. Välj Maximum..._image_name (den nyligen erhållna bildstacken) och välj Plugins | Bearbeta | Minimum (3D), när den nya bilden Minimum of Maximum..._image_name apears stänger Maximum... _image_name stacken.
    4. Välj Process-| i verktygsfältet. Hitta maxima.... Ett nytt fönster "Hitta maxima..." öppnas. Klicka på kryssrutan "Förhandsgranskningspunktsmarkering..." och fyll rutan "Brustolerans" med standardmakroinställningen 50. Maximapunkterna kommer att anges i bilden som små kors.
      1. Öka värdet "Brustolerans" om du observerar ett överskott av kommenterade aktiva zoner, dvs.
        1. Å andra sidan, om man observerar ofullständigt kommenterade aktiva zoner, dvs. Fortsätt att prova olika värden efter den här proceduren tills korsen är lämpligt märkta aktiva zoner i fokus. Fyll "Hitta maxima brustolerans" med det här värdet.
        2. Se figur 2C för ett exempel. För många aktiva zoner identifieras. I figur 2C upptäcks endast de aktiva zoner som är i fokus när värdet "Maxima brustolerans" ökar.
    5. Kör undermakroet "Analysera" för de representativa bilder som valts i steg 5.1, med inställningarna definierade i alla föregående steg.
  7. Justera Brp-puncta nedre och övre tröskel
    1. Observera att en ny fil visas när makrot körs enligt steg 6.6, som kallas 2_active_zone_stack_image_name. I den här bildstacken indikeras de aktiva zoner som identifieras av funktionen "Hitta maxima" med vita punkter i varje plan.
    2. Öppna den här filen genom att dra och släppa den i verktygsfältet och välj Bild | Stapla | Z-projekt | Projektionstyp = Summasegment. En projektion av 2_active_zone_stack_image_name kommer att erhållas.
    3. Välj Bild | Justera | Tröskel. Ett nytt fönster "Tröskelvärde" öppnas. Skjut den övre stapeln för att välja ett tröskelvärde där alla önskade foci/Brp-positiva fläckar visualiseras i rött.
      OBS: Om tröskelvärdet är för lågt räknas ett överskott av aktiva zoner. Om den är för hög kommer en bråkdel av de aktiva zonerna att missas.
      1. Se figur 2E till exempel. När tröskelvärdet är inställt på 400 inkluderas inte de flesta aktiva zoner (symboliserade som en 1 pixels högborgar) i segmenteringen, eftersom de inte är markerade i rött (figur 2E). När tröskelvärdet är inställt på värdet 50 markeras alla aktiva zoner i rött(figur 2E').
    4. Definiera det här värdet som minimitröskel. Lämna "Övre punctatröskel" på det maximala värdet.
    5. Kör undermakroet "Analysera" igen för de representativa bilderna med inställningarna definierade i alla föregående steg i det här avsnittet. Utvärdera de resulterande bildfilerna kritiskt och se till att segmenteringen görs korrekt. Om så inte är fallet justerar du inställningarna beroende på segmenteringsfelens art (figur 1, tabell 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 1
Figur 1: Exempel på olämpliga makrosegmenteringsresultat. Resultatbilder efter att ha kört"Drosophila NMJ Morphometrics" eller "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics ". Delar av den synaptiska terminalen ingår inte i den gula konturen (A). Delar av bakgrunden ingår i den synaptiska terminalen av den gula konturen (B). Blå skelettlinje sträcker sig bortom synaptisk terminal (C - D). För många aktiva zoner upptäcks (E - E'). Vissa aktiva zoner är fortfarande oupptäckta av analysen (G - G '). Aktiva zoner identifieras utanför synapsen (F). Felaktig boutonsegmentering (Gäller endast vid körning av Drosophila NMJ Bouton Morphometrics), boutons missas (H) eller för många boutons upptäcks av segmenteringen (I). Partiklar som kristaller eller damm som ingår i bakgrunden ingår i segmenteringen (J). Information om hur du ändrar inställningarna för att undvika dessa fel finns i tabell 1. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Exempel på makroinställningsjusteringar och deras konsekvenser för bildsegmentering. (A) Subtrahera bakgrundsförhandsvisning av en Dlg-1 immunolabelerad synaps, avbildad på ett fluorescensmikroskop med ApoTome, när "Rolling ball radius" är inställd på 20(A)eller 500(A'). (B) Utdatabilder som erhållits efter körning | Justera | Automatisk tröskel | Prova alla avbildningar illustrerar bildsegmenteringar som erhållits av de 16 olika algoritmerna för automatiskt tröskelvärden. C)Förhandsversionen av "Hitta Maxima" när du ställer in "Bullertolerans" vid 50( C) och 500 (C '); Aktiva zoner som identifieras av segmenteringen är märkta med ett litet kors. (D) Mätning av de "små partiklar" som förekommer i bildbakgrunden hos en synaps immunolabelerad med anti-Hrp, avbildad på ett konfokalt mikroskop. e)Projektionen "Sum slices" som erhållits 2_active_zone_stack_ima ge_name. Tröskelvärdet är satt till 400(E)och till 50(E'). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Segmentering Observerade fel Exempel Nödvändiga justeringar
NMJ-område och omkrets
(Representeras av gul kontur i resultatbilden)
Delar av synaptiska terminalen ingår inte heller
i den gula konturen eller delar av bakgrunden
ingår i den synaptiska terminalen som beskrivs i gult.
Figur 2A-B Justera värdet "Rolling Ball Radius".
Se avsnitt 6.1.
Justera "NMJ-dispositionströskel".
Se avsnitt 6.2.
NMJ-längdrelaterade parametrar
(Representeras av blå skelettlinje i resultatbilden)
Blå skelettlinje sträcker sig antingen bortom eller
finns inte längs hela synaptiska terminalen.
Figur 2C-D Justera värdet "Rolling Ball Radius".
Se avsnitt 6.1.
Justera "NMJ-dispositionströskel".
Se avsnitt 6.2.
Brp-positiv puncta
(Representeras av punkter i resultatbilden)
För många aktiva zoner identifieras. Figur 2E-E' Minska värdet "Hitta maxima brustolerans".
Se avsnitt 6.5.
Brp-positiv puncta
(Representeras av punkter i resultatbilden)
Aktiva zoner missas av analysen. Figur 2G-G' Öka värdet "Hitta maxima brustolerans".
Se avsnitt 6.5.
Minska "Brp-puncta lägre tröskel".
Se avsnitt 6.6.
Brp-positiv puncta
(Representeras av punkter i resultatbilden)
Aktiva zonartefakter identifieras
utanför den synaptiska terminalen.
Figur 2F Justera avsnitt 6.2 i avsnittet Aktiv zon. Öka "Brp-puncta lägre tröskel".
Se avsnitt 6.6.
Små partiklar Partiklar sådana kristaller eller damm som ingår i
av bakgrunden verkar ingå i
segmenteringen.
Figur 2J Välj rutan "Ta bort små partiklar".
Se avsnitt 6.3.
Bestäm maximal storlek på små partiklar.
Se avsnitt 6.3.
Bouton segmentering Felaktig boutonsegmentering
(Gäller endast Drosophila NMJ Bouton Morphometrics;
Använd inte Drosophila NMJ Morphometrics för boutonsegmentering).
Bild 2H-I Justera "NMJ-dispositionströskel".
Se avsnitt 6.1.
Bestäm "minsta boutonstorlek".
Se avsnitt 6.4.

Tabell 1: Felsökningsguide för de olika typer av fel i bildsegmentering som kan produceras av makrona. I den här tabellen beskrivs olika typer av bildsegmenteringsfel som produceras av makrona. Dessa kan enkelt upptäckas i resultatbilderna. Exempel på varje feltyp visas i figur 1. I avsnittet "justeringar" i tabellen markeras de inställningar som behöver justeras och användaren hänvisas till det kritiska understeget i avsnitt 6, som beskriver hur du justerar dessa inställningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Immunostaining Dilution
Mouse anti-discs large 1 Developmental Studies Hybridoma Bank AFFN-DLG1-4D6 1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Rabbit anti-horseradish peroxidase Jackson IR 323-005-021 1/500
Rabbit anti-Synaptotagmin Gift from Hugo Bellen Jan-00
Mouse anti-Cysteine string protein Developmental Studies Hybridoma Bank DCSP-1(ab49) 1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Mouse anti-Bruchpilot Developmental Studies Hybridoma Bank nc82 Jan-50
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 Life technologies A11029 1/200
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 Life technologies A11011 1/500
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit ThermoFisher Z25006
ProLong Gold Antifade Mountant ThermoFisher P36930
Equipment
Confocal microscope or fluorescence microscope Leica SP5
Zeiss Axio imager
Computer Mac or Pc
Software
FIJI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Tags

Tomt värde ärende
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter