Zwei-Photonen-Laser-induzierte neuronale Verletzung: Eine Methode zur Beobachtung der Axondegeneration und Regeneration bei Drosophila Larven

Overview

Dieses Video beschreibt die zweiphotonen Laserablation von Axonen in einer Drosophila melanogaster Larve und ein Beispielprotokoll, um Verletzungen zu induzieren und die Verletzungsstelle abzubilden.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Li et al.,A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System, J. Vis. Exp. (2018).

1. Zwei-Photonen-Verletzung und konfokale Bildgebung

1. Mikroskop-Setup
   HINWEIS: Für dieses Experiment wurde ein konfokales Laserscanmikroskop mit einem Zwei-Photonen-Laser verwendet, aber auch andere Systeme mit entsprechender Einrichtung reichen aus. Der Zwei-Photonen-Laser (930 nm) wurde zur Verletzung samtiert und ein Argon-Laser (488 nm) wurde zur konfokalen Bildgebung von GFP eingesetzt.
   1. Schalten Sie zu Beginn jeder Sitzung den Zwei-Photonen-Laser und/oder den konfokalen Laser(n) und das Mikroskop ein. Öffnen Sie die Bildverarbeitungssoftware.
   2. Für zwei Photonenverletzungen sollten Sie mit dem Zweiphotonenlaser bei 930 nm (1.950 mW) die folgenden Parameter für die Bildgebung von GFP einrichten.
      1. Wählen Sie den Linienscanmodus aus. Öffnen Sie das Loch den ganzen Weg. Erhöhen Sie die Laserintensität auf 20 % (390 mW).
      2. Wählen Sie 512 x 512 als Frame-Scan aus. Verwenden Sie die maximale Scangeschwindigkeit (in der Regel mit der Pixelverweilzeit bei 0,77 s). Stellen Sie sicher, dass die durchschnittliche Anzahl 1 und die Bittiefe 8 Bit beträgt.
      3. Legen Sie die Verstärkung auf 750 € fest, und den Offset auf 0.
      4. Speichern Sie dieses voreingestellte experimentelle Protokoll als 2P GFP 930 Ablation, was eine einfache Wiederverwendung in zukünftigen Experimenten ermöglicht.
   3. Richten Sie für die konfokale Bildgebung die folgenden Parameter für die Bildgebung von GFP mit dem Argon-Laser bei 488 nm ein:
      1. Wählen Sie die Registerkarte "Erfassung" und dann Z-stackaus.
      2. Schalten Sie unter "Laser" die Leistung für den 488 nm Argon Laser ein.
      3. Gehen Sie zu Kanäle, wählen Sie den 488 mm Laser, und erhöhen Sie die Laserleistung auf 5-10%. Verwenden Sie für das Loch die luftige Einheit 1-2 (AU). Stellen Sie die Verstärkung auf 650 ein.
      4. Wählen Sie im Erfassungsmodus1024 x 1024 als Frame-Scan aus, verwenden Sie die maximale Scangeschwindigkeit, eine durchschnittliche Anzahl von 2 und eine Bittiefe von 8 Bit.
      5. Speichern Sie dieses voreingestellte experimentelle Protokoll als GFP Imaging.
2. Larvenanästhesie mit Diethylether und Montage
   1. In eine Dunstabzugshaube geben Sie eine 60-mm-Glasschale in eine 15-cm-Kunststoff-Petrischale. Falten und legen Sie ein Stück Tissuepapier an der Unterseite der Glasschale, dann legen Sie einen Traubensaft Agar Teller auf das Gewebe. Fügen Sie Diethylether in die Glasschale, bis zu dem Punkt, wo das Gewebepapier eingeweicht wird und es eine Schicht von flüssigem Äther in der Schale übrig. Halten Sie den Deckel jederzeit auf.
   2. Bereiten Sie eine Glasrutsche mit einem Tropfen Halocarbon 27 Öl in der Mitte vor. Fügen Sie 4 Flecken Vakuumfett auf die vier Ecken des Schlittens, um später den Deckelzuschlag zu unterstützen.
   3. Verwenden Sie Zangen, um eine gereinigte Larve aufzunehmen und auf die Agarplatte in der 60-mm-Glasschale zu legen. Bedecken Sie die Glasschale mit ihrem Deckel und warten Sie, bis sich die Larve nicht mehr bewegt. Für PNS-Verletzung/Bildgebung, nehmen Sie die Larve heraus, sobald ihr Schwanz aufhört zu zuzucken. Warten Sie für das ZNS, bis die gesamte Larve regungslos wird, insbesondere die Kopfsegmente.
      HINWEIS: Der Zeitpunkt der Ätherexposition ist entscheidend. Siehe Diskussion.
   4. Nehmen Sie die anästhesierte Larve vorsichtig auf und legen Sie sie kopfauf in den Tropfen Halocarbonöl auf der Rutsche. Fügen Sie einen Coverslip auf der Folie hinzu. Verwenden Sie sanften Druck, um auf den Deckelzuschlag zu drücken, bis er die Larve berührt (Abbildung 1A).
   5. Passen Sie die Position der Larve an, indem Sie den Deckelrutsch sanft nach links oder rechts schieben, um die Larve zu rollen, so dass sich das Neuron/Axon/Dendrit von Interesse auf der Oberseite und am nächsten an der Mikroskoplinse befindet.
   6. Für PNS-Verletzungen, montieren Sie die Larve dorsale Seite nach oben, so dass beide Luftröhren sichtbar sind. Dann rollen Sie die Larve 30 Grad nach links für die Verletzung Klasse III da Neuron Axone (Abbildung 1B und 1C), 90 Grad für die Verletzung Klasse IV da Neuron Axone (Abbildung 1B und 1E), oder 30 Grad für die Verletzung Klasse IV da Neuron Dendriten (Abbildung 2A).
   7. Bei ZNS-Verletzungen positionieren Sie die Larve perfekt ventrale Seite nach oben (Abbildung 3A), so dass der Interessenbereich der Mikroskoplinse in der Z-Ebene am nächsten ist.
3. Verletzung durch Zwei-Photonen-Laser
   1. Stellen Sie das Dia mit der Larve unter das Mikroskop und befesten Sie es mit dem Diahalter auf der Bühne. Verwenden Sie das 10X (0.3 NA) Objektiv, um die Larve zu finden.
   2. Fügen Sie 1 Tropfen Objektivöl auf den Deckelzettel, schalten Sie auf das 40X (1.3 NA) Objektiv um und passen Sie den Fokus an.
   3. Wechseln Sie in den Scanmodus und verwenden Sie das experimentelle Protokoll 2P GFP 930 Ablationwieder. Stellen Sie sicher, dass das Loch den ganzen Weg geöffnet ist.
      HINWEIS: Die Konfiguration muss auf Basis individueller Systeme optimiert werden.
   4. Starten Sie den Live-Modus, um den Interessenbereich (ROI) zu finden, und passen Sie die Einstellungen an, um eine gute Bildqualität mit dem entsprechenden Zoom zu erzielen.
      HINWEIS: Der Zweck dieses Schritts ist es, das Neuron/Axon/Dendrit zu finden, um zu verletzen, anstatt das beste Bild zu machen. Verwenden Sie daher die minimalen Einstellungen, die ausreichen, um den Zielbereich zu visualisieren, um Überbelichtung oder Photobleichungen zu vermeiden.
   5. Beenden Sie den Live-Scan, damit die Schaltfläche "Zuschneiden" verfügbar wird. Lassen Sie das Standbild als Roadmap dienen. Wählen Sie die Crop-Funktion aus, und passen Sie das Scanfenster an, um sich auf das zu verletzende Ziel zu konzentrieren.
   6. Reduzieren Sie den ROI, um die Größe des potenziellen Schadensortes zu erreichen. Zum Beispiel decken Sie einfach die Breite eines Axons oder eines Dendriten ab, um die Genauigkeit der Verletzung zu gewährleisten und Schäden an benachbarten Geweben zu reduzieren. Wenn gewünscht, zoomen Sie den ROI vor dem Zuschneiden, sodass eine genauere Verletzung möglich ist.
   7. Öffnen Sie ein neues Bildgebungsfenster. Reduzieren Sie die Scangeschwindigkeit und erhöhen Sie die Laserintensität. Bestimmen Sie die Erhöhung der Laserintensität basierend auf dem im Live-Modus gescannten Gewebefluoreszenzsignal.
   8. In der Regel, stellen Sie die Zwei-Photon-Laser-Intensität ab 25% für PNS-Verletzung und 50-100% für VNC-Verletzung. Stellen Sie bei PNS-Axonverletzungen sicher, dass die Laserintensität 480 mW und die Pixelverweilzeit 8,19 s beträgt. Achten Sie bei der VNC-Axonverletzung darauf, dass die Laserintensität und die Pixelverweilzeit in der Regel 965-1930 mW bzw. 8,19-32,77 s betragen.
   9. Starten Sie den kontinuierlichen Scan. Lassen Sie den Cursor über der Schaltfläche Kontinuierlich bewegen. Halten Sie ein wachsames Auge auf das Bild und stoppen Sie den Scan, sobald eine drastische Zunahme der Fluoreszenz beobachtet wird.
      HINWEIS: Das Auftreten der Fluoreszenzspitze ist auf die Autofluoreszenz an der Verletzungsstelle zurückzuführen.
   10. Wechseln Sie zurück in den Live-Modus, indem Sie die Einstellungen wiederverwenden. Finden Sie die Region von Interesse, die gerade durch Anpassen des Fokus zielgerichtet war.
       HINWEIS: Ein guter Hinweis auf eine erfolgreiche Verletzung ist das Auftreten eines kleinen Kraters, einer ringartigen Struktur oder lokalisierter Trümmer direkt an der Unfallstelle.
   11. Wechseln Sie zum nächsten Neuron und wiederholen Sie ab Schritt 1.3.5, um mehrere Neuronen in einem einzigen Tier zu verletzen. Oder wiederholen Sie Schritt 1.3.5, während Sie die Leistung schrittweise erhöhen und/oder die Scangeschwindigkeit reduzieren, wenn die anfängliche Verletzung nicht ausreicht.
       HINWEIS: Für den Fall, dass die Laserleistung zu hoch ist, wird ein großer beschädigter Bereich im Live-Scan-Bild nach der Verletzung sichtbar. Zu viele Verletzungen können zum Tod der Larve führen.
   12. Erholen Sie die Larve, indem Sie den Deckelvorsichtigen vorsichtig entfernen und die verletzte Larve mit Hefepaste auf eine neue Platte übertragen. Graben Sie mehrere Höhlen auf der Agarplatte mit Zange; alternativ, machen Sie eine Insel von Agar in der Platte, anstatt die ganze Platte zu verwenden, um die Möglichkeit der Larve aus der Platte kriechen zu reduzieren.
   13. Die Platte in eine 60-mm-Petrischale mit Nassgewebe (getränkt mit 0,5% Propionsäurelösung) und Kultur bei Raumtemperatur oder 25 °C geben.
       HINWEIS: Die Larve bleibt etwa einen zusätzlichen Tag bei Raumtemperatur (22 °C) im Larvenstadium im Alter, verglichen mit 25 °C.
4. Konfokale Bildgebung nach der Verletzung
   1. Stellen Sie die verletzte Larve zu den gewünschten Zeitpunkten auf, indem Sie die Larve mit dem gleichen Verfahren der Anästhesie und Montage wie in Schritt 1.2 vorbereiten, dann die Bildgebung mit dem konfokalen Laser.
      HINWEIS: Stellen Sie sich die Larve bei 24 h nach einer Verletzung (AI) vor, um eine axonale Verletzung zu bestätigen, und bei 48 h AI (Klasse IV da Neuronen) oder 72 h AI (Klasse III da Neuronen), um die Regeneration zu beurteilen.
   2. Suchen Sie die Larve mit dem 10X-Objektiv, und wechseln Sie dann zu einem 25X (0.8 NA) Objektiv. Verwenden Sie das experimentelle Protokoll GFP Imagingwieder.
   3. Klicken Sie auf die Live-Schaltfläche und finden Sie das gleiche Neuron verletzt zuvor.
   4. Legen Sie die erste und letzte Z-Position im Live-Scanfenster fest. Drücken Sie Stop and Click Start experiment to acquire a Z-stack image.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass bei der Aufnahme von Bildern ein Normalisierungspunkt (der Axonkonvergierende Punkt) enthalten ist, damit eine Quantifizierung der Regeneration möglich ist (Abbildung 1D, 1F) – dies wird im Abschnitt Datenanalyse weiter erläutert.
   5. Wechseln Sie zur Bildverarbeitung, wählen Sie das gerade aufgenommene Bild aus und erzeugen Sie eine maximale Intensitätsprojektion. Speichern Sie sowohl die Z-Stack- als auch die Projektionsbilder mit maximaler Intensität.

Representative Results

Abbildung 1: Die Regeneration des Da-Neuron-Axons in der Peripherie zeigt die Klassenspezifität an. (A und B) Schematische Zeichnung, die die Position der Larven zeigt. (C) Schematische Zeichnung der Klasse III da Neuronen. (D) Axone der Klasse III da neurons ddaF, beschriftet mit 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+, nicht nachwachsen. (E) Schematische Zeichnung der Klasse IV da Neuronen. (F) Axone der Klasse IV da neurons v'ada, beschriftet mit ppk-CD4-tdGFP/+, nachwachsen über die Läsionsstelle hinaus. (D und F) Rote Linie gibt Axonlänge an, während grüne gestrichelte Linie den Abstand zwischen dem Zellkörper und dem Axonkonvergierenden Punkt (DCAC) markiert. Der blaue Punkt markiert den axonkonvergierenden Punkt. Maßstabsleiste = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Da Neuron Dendrit Regeneration. (A) Illustrative Darstellung der Klasse IV da Neuronen. (B) Illustrative Darstellung der Dendritenregeneration in klasse IV da neuron ddaC, beschriftet durch ppk-CD4-tdGFP/+. Die Laserablation ist auf den primären Astpunkt ausgerichtet und wird bei 48 h AEL durchgeführt. Bei 24 h AI wird eine Übertragung des Neurites bestätigt und bei 72 h wird die Ki-Regeneration quantifiziert. Dendriten von ddaC Neuronen zeigen ein erhebliches Nachwachsen, wobei neue dendritische Zweige aus dem abgetrennten Stamm sprießen, um den freien Raum zu fliessen. Es ist erwähnenswert, dass in dieser Entwicklungsphase kontinuierlich neue Terminalzweige zu den unverletzten Dendriten hinzukommen. Maßstabsleiste = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Da Neuron Axon Regeneration im VNC. (A) Schematische Zeichnung einer Drosophila-Larve, die auf einem Dia montiert und unter dem Mikroskop abgebildet ist. Klasse IV da Neuron Axone im VNC visualisiert in einer ppk-CD4tdGFP/+ Larve. Zwei Kandidaten-Commissure-Segmente werden im vergrößerten Bild und in der schematischen Zeichnung angezeigt. Jeder von ihnen hat zwei Verletzungsstellen (rote Kreise). (B) Konfokale Bilder eines verletzten Segments, das nach einer Verletzung bei 8, 24 und 72 h abgebildet wird (AI). Rote Linien zeigen die nachwachsenden Axone. (C) Messung und Normalisierung nachwachsender Axone. Maßstabsleiste = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	59-133
Propionic Acid	J.T.Baker	U33007
Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent