Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

פגיעה עצבית הנגרמת על ידי לייזר דו פוטון: שיטה להתבונן ניוון אקסון והתחדשות בזחלים Drosophila

Overview

וידאו זה מתאר אבלציה לייזר שני פוטון של אקסונים בזחל מלנוגאסטר Drosophila ופרוטוקול לדוגמה כדי לגרום לפציעה ולצלם את אתר הפציעה.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Li et al., מודל פגיעה Drosophila ב Vivo לחקר נוירורוגנרציה במערכת העצבים ההיקפית והמרכזית, J. Vis. Exp. (2018).

1. פגיעה בשני פוטונים והדמיה קונפוקלית

  1. הגדרת מיקרוסקופ
    שים לב: מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקל עם לייזר שני פוטון שימש לניסוי זה, אבל מערכות אחרות עם התקנה שווה ערך יהיה גם מספיק. לייזר שני פוטון (930 ננומטר) שימש לאספקת פציעה לייזר ארגון (488 ננומטר) שימש הדמיה confocal של GFP.
    1. בתחילת כל מפגש, הפעל את לייזר שני פוטון ו / או לייזר confocal(ים), ואת המיקרוסקופ. פתח את תוכנת ההדמיה.
    2. עבור פגיעה בשני פוטון, הגדר את הפרמטרים הבאים להדמיית GFP עם לייזר שני פוטון ב 930 ננומטר (1,950 mW).
      1. בחר מצב סריקת קו. פתח את חור הסיכה לאורך כל הדרך. הגבר את עוצמת הלייזר ל- ~ 20% (390 mW).
      2. בחר 512 x 512 כסריקת המסגרת. השתמש במהירות סריקה מרבית (בדרך כלל עם זמן השתהות הפיקסל ב- 0.77 μs). ודא שהמספר הממוצע הוא 1 ועומק הסיביות הוא 8 סיביות.
      3. הגדר את הרווח ל- ~ 750 ואת ההיסט ל- 0.
      4. שמור פרוטוקול ניסיוני מוגדר מראש זה כמו 2P GFP 930 אבלציה, המאפשר שימוש חוזר קל בניסויים עתידיים.
    3. להדמיה קונפוקלית, הגדר את הפרמטרים הבאים להדמיית GFP באמצעות לייזר ארגון ב- 488 ננומטר:
      1. בחר בכרטיסיה רכישה ולאחר מכן במחסנית Z.
      2. תחת "לייזר", הפעל את הכוח עבור לייזר ארגון 488 ננומטר.
      3. עבור אל ערוצים, בחר לייזר 488 מ"מ, ולהגדיל את כוח הלייזר ל 5-10%. עבור חור הסיכה, השתמש ביחידה אוורירית 1-2 (AU). כוונן את הרווח ל-650.
      4. במצב רכישה, בחר 1024 x 1024 כסריקת המסגרת, השתמש במהירות הסריקה המרבית, במספר ממוצע של 2 ובעומק סיביות של 8 סיביות.
      5. שמור פרוטוקול ניסיוני מוגדר מראש זה כהדמיית GFP.
  2. הרדמה זחלים עם אתר דיתיל והרכבה
    1. במכסה המנוע, מניחים צלחת זכוכית 60 מ"מ בצלחת פטרי מפלסטיק 15 ס"מ. מקפלים ומניחים פיסת נייר טישו בתחתית צלחת הזכוכית, ולאחר מכן מניחים צלחת אגר מיץ ענבים על הרקמה. מוסיפים אתר diethyl לתוך צלחת הזכוכית, עד לנקודה שבה נייר הרקמה ספוג ויש שכבה של אתר נוזלי שנותר בצלחת. שמור על המכסה כל הזמן.
    2. מכינים מגלשת זכוכית עם טיפה אחת של שמן הילה 27 במרכז. הוסף 4 כתמים של שומן ואקום על ארבע הפינות של השקופית, כדי לתמוך מאוחר יותר את כיסוי.
    3. השתמשו במלקחיים כדי להרים זחל נקי ולהניח אותו על צלחת האגר בצלחת הזכוכית 60 מ"מ. מכסים את צלחת הזכוכית במכסה שלה ומחכים עד שהזחל מפסיק לזוז. לפציעה/הדמיה של מערכת העצבים המרכזית, הוציאו את הזחל ברגע שהזנב שלו מפסיק להתעוות. עבור מערכת העצבים המרכזית, המתן עד שהזחל כולו יהפוך לחסר תנועה, במיוחד מקטעי הראש.
      שים לב: העיתוי של חשיפה לאתר הוא קריטי. ראה דיון.
    4. בזהירות להרים את הזחל מורדם ומניחים אותו ראש זקוף לתוך טיפת שמן halocarbon על המגלשה. הוסף כיסוי מעל השקופית. השתמשו בלחץ עדין כדי לדחוף כלפי מטה את העטיפה, עד שהיא נוגעת בזחל (איור 1A).
    5. להתאים את המיקום של הזחל על ידי בעדינות דוחף את הכיסוי לכיוון שמאל או ימין כדי לגלגל את הזחל, כך הנוירון / אקסון / dendrite של עניין הוא על החלק העליון הקרוב ביותר לעדשת מיקרוסקופ.
    6. עבור פציעה PNS, לעלות את הצד הגב זחל למעלה, כך שתי קנה הנשימה גלויים. ואז לגלגל את הזחל ~ 30 מעלות שמאלה לפציעת מחלקה III da נוירון אקסונים (איור 1B ו 1C),90 מעלות לפציעת מחלקה IV da שרירי עצב(איור 1B ו 1E),או ~ 30 מעלות לפציעת מחלקה IV דה נוירון דנדריטים ( איור2A).
    7. עבור פגיעה במערכת העצבים המרכזית, מקמו את הזחל כצד גחוני לחלוטין כלפי מעלה (איור 3A), כך שאזור העניין הקרוב ביותר לעדשת המיקרוסקופ במישור z.
  3. פציעה על ידי לייזר שני פוטון
    1. הנח את השקופית עם הזחל מתחת למיקרוסקופ ואבטח אותה במקומה עם מחזיק השקופית על הבמה. השתמש במטרה 10X (0.3 NA) כדי למצוא את הזחל.
    2. הוסף טיפה 1 של שמן אובייקטיבי על כיסוי, לעבור למטרה 40X (1.3 NA) ולהתאים את המוקד.
    3. עבור למצב הסריקה ופעל מחדש בפרוטוקול הניסיוני 2P GFP 930 אבלציה. ודא חור הסיכה נפתח כל הדרך.
      שים לב: יש למטב את התצורה בהתבסס על מערכות בודדות.
    4. הפעל את מצב Live כדי לאתר את אזור העניין (ROI) ולכוונן את ההגדרות כדי להשיג איכות תמונה טובה עם הזום המתאים.
      שים לב: מטרת צעד זה היא למצוא את הנוירון / אקסון / dendrite לפצוע, במקום לקחת את התמונה באיכות הטובה ביותר. לכן, השתמש בהגדרות המינימליות מספיק כדי לדמיין את אזור היעד, על מנת למנוע חשיפת יתר או photobleaching.
    5. הפסק סריקה חיה, כך שלחצן חתוך יהפוך לזמין. תן לתמונת הסטיה לשמש כמפת הדרכים. בחר בפונקציה Crop והתאם את חלון הסריקה כך שיתמקד ביעד שייפצע.
    6. להקטין את ההחזר על ההשקעה כדי להיות בגודל של האתר הפוטנציאלי של פציעה. לדוגמה, רק לכסות את הרוחב של אקסון או דנדריל, כדי להבטיח את הדיוק של הפציעה ולהפחית את הנזק לרקמות השכנות. אם תרצה, הגדל את ההחזר על ההשקעה לפני החיתוך, מה שיאפשר פגיעה מדויקת יותר.
    7. פתח חלון דימות חדש. הפחת את מהירות הסריקה והגדל את עוצמת הלייזר. קבעו את העלייה בעוצמת הלייזר בהתבסס על אות הפלואורסצנטיות של הרקמה שנסרק במצב Live.
    8. בדרך כלל, הגדר את עוצמת הלייזר של שני פוטון החל מ- 25% עבור פגיעה ב- PNS ו- 50-100% עבור פגיעה ב- VNC. עבור פציעת אקסון PNS, ודא כי עוצמת הלייזר היא ~ 480 mW וזמן להתעכב פיקסל הוא 8.19 μs. עבור הפציעה אקסון VNC, להבטיח כי עוצמת הלייזר וזמן להתעכב פיקסל הם בדרך כלל 965-1930 mW ו 8.19-32.77 מיקרוס, בהתאמה.
    9. הפעל סריקה רציפה. השאר את הסמן מרחף מעל לחצן רציף. לפקוח עין על התמונה ולהפסיק את הסריקה ברגע עלייה דרסטית פלואורסצנטיות נצפתה.
      שים לב: המראה של ספייק פלואורסצנטיות נובע פלואורסצנטיות אוטומטית באתר הפציעה.
    10. חזור למצב Live על-ידי שימוש חוזר בהגדרות. מצא את אזור העניין שהיה ממוקד רק על ידי התאמת המיקוד.
      שים לב: אינדיקציה טובה לפציעה מוצלחת היא הופעתו של מכתש קטן, מבנה דמוי טבעת או פסולת מקומית ממש באתר הפציעה.
    11. לעבור לנוירון הבא ולחזור משלב 1.3.5, כדי לפגוע נוירונים מרובים בבעלי חיים בודדים. לחלופין, חזור על שלב 1.3.5 תוך הגדלה הדרגתית של העוצמה ו/או הפחתת מהירות הסריקה אם הפציעה הראשונית לא הייתה מספקת.
      שים לב: במקרה שכוח הלייזר גבוה מדי, אזור פגום גדול ייראה בתמונת הסריקה החיה שלאחר הפציעה. פציעה רבה מדי עלולה לגרום למוות של הזחל.
    12. לשחזר את הזחל על ידי הסרת בזהירות את הכיסוי והעברת הזחל הפצוע על צלחת חדשה עם משחת שמרים. השליכו מספר מערות על לוחית האגר עם מלקחיים; לחלופין, להפוך אי של אגר בצלחת במקום להשתמש בכל הצלחת, כדי להפחית את האפשרות של הזחל זוחל מתוך הצלחת.
    13. שים את הצלחת בצלחת פטרי 60 מ"מ עם רקמה רטובה (ספוג 0.5% פתרון חומצה פרופוני) ותרבות בטמפרטורת החדר או 25 מעלות צלזיוס.
      שים לב: הזחל יישאר בשלב הזחל במשך כיום נוסף בטמפרטורת החדר (22 °C (69 °F) לעומת ב 25 °C (69 °F).
  4. הדמיה קונפוקלית לאחר פציעה
    1. תמונה הזחל הפצוע בנקודות הזמן הרצויות על ידי הכנת הזחל באמצעות אותו הליך של הרדמה הרכבה כמו בשלב 1.2, ולאחר מכן הדמיה עם לייזר confocal.
      שים לב: תמונה הזחל ב 24 שעות לאחר פציעה (AI) כדי לאשר פגיעה אקסונלית ב 48 h AI (מחלקה IV da נוירונים) או 72 h AI (מחלקה III da נוירונים) כדי להעריך התחדשות.
    2. אתר את הזחל באמצעות המטרה 10X ולאחר מכן עבור למטרה 25X (0.8 NA). השתמש חוזר בפרוטוקול הניסיוני GFP הדמיה.
    3. לחץ על לחצן חי ומצא את אותו נוירון שנפצע בעבר.
    4. הגדר את מיקומי Z הראשונים והאחרונים בחלון הסריקה החיה. לחץ על עצור ולחץ על התחל ניסוי כדי להשיג תמונת מחסנית Z.
      שים לב: ודא שנקודת נורמליזציה (נקודת ההתכנסות של האקסון) נכללת בעת לכידת תמונות כך שכימות של יצירה מחדש אפשרי (איור 1D, 1F) - הדבר נדון בהמשך בסעיף ניתוח הנתונים.
    5. עבור לעיבוד תמונה, בחר את התמונה שצולמה זה עתה וצור הקרנה בעוצמה מרבית. שמרו גם את ערימת z וגם את תמונות ההקרנה בעוצמה המרבית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 1
איור 1: התחדשות האקסון של הנוירונים בפריפריה מציגה ספציפיות מעמדית. (A ו- B) ציור סכמטי המציג את מיקום הזחלים. (C) ציור סכמטי של נוירונים מסוג III da. (D)אקסונים של מחלקה III da נוירונים ddaF, שכותרתו 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+, אינם מצליחים לצמוח מחדש. (E) ציור סכמטי של נוירונים מחלקה IV da. (F) אקסונים של מחלקה IV da נוירונים v'ada, שכותרתו ppk-CD4-tdGFP/+, לגדול מחדש מעבר לאתר הנגע. (D ו- F) קו אדום מציין את אורך האקסון בעוד קו מקווקו ירוק מסמן את המרחק בין גוף התא לבין נקודת ההתכנסות של האקסון (DCAC). הנקודה הכחולה מסמנת את נקודת ההתכנסות של האקסון. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר.

Figure 2
איור 2: התחדשות דנדריט של נוירון Da. (A) המחשת ייצוג של נוירונים מסוג IV da. (B) המחשה של התחדשות דנדריט במחלקה IV da נוירון ddaC, שכותרתו על ידי ppk-CD4-tdGFP/+. אבלציה בלייזר מיועדת לנקודת הסניף העיקרית ומתבצעת במהירות של 48 שעות AEL. ב 24 שעות פגיעה AI transection של neurite הוא אישר, ו ב 72 שעות התחדשות AI הוא כמת. דנדריטים של נוירונים ddaC להפגין צמיחה מחדש משמעותית, עם ענפים דנדריטיים חדשים צומחים מן הגבעול הכרות כדי לפרוש את החלל הפנוי. ראוי לציין כי ענפי טרמינל חדשים מתווספים ללא הרף לדנדריטים הבלתי נפגעים בשלב התפתחותי זה. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר.

Figure 3
איור 3: התחדשות האקסון של הנוירון ב-VNC. (A) ציור סכמטי של זחל דרוזופילה רכוב על שקופית ומדויק מתחת למיקרוסקופ. אקסונים של נוירונים בדרגה IV da ב- VNC דמיינו בזחל ppk-CD4tdGFP/+ . שני מקטעי קומיסר מועמד מוצגים בתמונה המוגדלת ובציור הסכימטי. לכל אחד מהם יש שני אתרי פציעה (עיגולים אדומים). (B)תמונות קונפוקל של קטע פצוע אחד בתמונה ב 8, 24 ו 72 שעות לאחר פציעה (AI). קווים אדומים מתארים את האקסונים הצומחים מחדש. (C) מדידה ונורמליזציה של אקסונים מגודלים מחדש. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous Acros Organics AC615080010
Halocarbon 27 Oil Genesee Scientific 59-133
Propionic Acid J.T.Baker U33007
Cover Glasses: Rectangles Fisher Scientific 12-544-D 50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope Zeiss
Zen software Zeiss
Chameleon Ultra II Coherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Tags

ערך ריק הנפקה
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter