दो फोटॉन लेजर प्रेरित तंत्रिका चोट: ड्रोसोफिला लार्वा में एक्सोन अध: पतन और उत्थान का निरीक्षण करने के लिए एक विधि

Overview

इस वीडियो में एक ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर लार्वा में एक्सोन के दो फोटॉन लेजर एब्लेशन और चोट साइट को प्रेरित करने और छवि बनाने के लिए एक उदाहरण प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल पेरिफेरल और सेंट्रल नर्वस सिस्टम, जे विस एक्सप्रेस (2018) में न्यूरोरेजेनरेशन का अध्ययन करने के लिए वीवो इंजरी मॉडल में ली एट अल(2018) का एक अंश है।

1. दो फोटॉन चोट और कॉन्फोकल इमेजिंग

1. माइक्रोस्कोप सेटअप
   नोट: इस प्रयोग के लिए दो फोटॉन लेजर के साथ एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया गया था, लेकिन समकक्ष सेटअप वाले अन्य सिस्टम भी पर्याप्त होंगे। दो फोटॉन लेजर (930 एनएम) का इस्तेमाल चोट पहुंचाने के लिए किया गया था और जीएफपी के कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए आर्गन लेजर (488 एनएम) का इस्तेमाल किया गया था।
   1. प्रत्येक सत्र की शुरुआत में, दो फोटॉन लेजर और/या कॉन्फोकल लेजर (एस), और माइक्रोस्कोप चालू करें । इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें।
   2. दो फोटॉन चोट के लिए, 930 एनएम (1,950 मिलियन) पर दो फोटॉन लेजर के साथ इमेजिंग जीएफपी के लिए निम्नलिखित मापदंडों की स्थापना करें।
      1. लाइन स्कैन मोड का चयन करें। सभी तरह से पिनहोल खोलें। लेजर तीव्रता को ~ 20% (390 mW) तक बढ़ाएं।
      2. फ्रेम स्कैन के रूप में 512 x 512 का चयन करें। अधिकतम स्कैनिंग गति का उपयोग करें (आमतौर पर पिक्सेल के साथ 0.77 माइक्रोन पर समय रहता है)। सुनिश्चित करें कि औसत संख्या 1 है और थोड़ी गहराई 8 बिट्स है।
      3. ~ 750 करने के लिए लाभ सेट करें, और 0 के लिए ऑफसेट।
      4. इस पूर्व-निर्धारित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को 2P GFP 930 एब्लेशनके रूप में सहेजें, जिससे भविष्य के प्रयोगों में आसान पुन: उपयोग की अनुमति दी जा सके।
   3. कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए, 488 एनएम पर आर्गन लेजर के साथ इमेजिंग जीएफपी के लिए निम्नलिखित पैरामीटर सेट करें:
      1. अधिग्रहण टैब और फिर जेड-स्टैक काचयन करें ।
      2. "लेजर"के तहत, 488 एनएम आर्गन लेजर के लिए शक्ति चालू करें।
      3. चैनलोंपर जाएं, 488 मिमी लेजर का चयन करें, और लेजर पावर को 5-10% तक बढ़ाएं। पिनहोल के लिए 1-2 हवादार यूनिट (एयू) का इस्तेमाल करें। लाभ को 650 तक समायोजित करें।
      4. अधिग्रहण मोडमें, फ्रेम स्कैन के रूप में 1024 x 1024 का चयन करें, अधिकतम स्कैन गति, 2 की औसत संख्या और 8 बिट की थोड़ी गहराई का उपयोग करें।
      5. जीएफपी इमेजिंगके रूप में इस पूर्व निर्धारित प्रायोगिक प्रोटोकॉल को बचाएं।
2. डायथाइल ईथर और बढ़ते के साथ लार्वा संज्ञाहरण
   1. धूम हुड में 15 सेमी प्लास्टिक पेट्री डिश में 60 एमएम की ग्लास डिश रखें। फोल्ड करें और ग्लास डिश के नीचे टिश्यू पेपर का एक टुकड़ा रखें, फिर टिश्यू पर अंगूर का रस आगर प्लेट रखें। ग्लास डिश में डाइथाइल ईथर जोड़ें, उस बिंदु पर जहां ऊतक पेपर भिगोया जाता है और पकवान में तरल ईथर की एक परत शेष होती है। ढक्कन हर समय चालन रखें।
   2. केंद्र में हेलोकार्बन 27 तेल की एक बूंद के साथ एक गिलास स्लाइड तैयार करें। बाद में कवरस्लिप का समर्थन करने के लिए स्लाइड के चार कोनों पर वैक्यूम तेल के 4 धब्बे जोड़ें।
   3. एक साफ लार्वा लेने के लिए संदंश का उपयोग करें और इसे 60-मिमी ग्लास डिश में आगर प्लेट पर रखें। ग्लास डिश को इसके ढक्कन से ढककर रखें और तब तक इंतजार करें जब तक कि लार्वा हिलना बंद न हो जाए। पीएनएस इंजरी/इमेजिंग के लिए जैसे ही इसकी पूंछ हिलना बंद हो जाती है, लार्वा बाहर निकाल लें । सीएनएस के लिए, तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि पूरा लार्वा स्थिर न हो जाए, विशेष रूप से सिर खंड।
      नोट: ईथर एक्सपोजर का समय महत्वपूर्ण है। चर्चा देखें।
   4. ध्यान से एनेस्थेटाइज्ड लार्वा उठाएं और स्लाइड पर हेलोकार्बन तेल की बूंद में इसे सिर-सीधा रखें। स्लाइड के शीर्ष पर एक कवरलिप जोड़ें। कवरस्लिप पर नीचे धकेलने के लिए कोमल दबाव का उपयोग करें, जब तक कि यह लार्वा(चित्रा 1ए) को छू नजाए।
   5. लार्वा को रोल करने के लिए बाएं या दाएं की ओर धीरे-धीरे कवरस्लिप को धक्का देकर लार्वा की स्थिति को समायोजित करें, ताकि न्यूरॉन/एक्सॉन/डेंड्राइट ऑफ इंटरेस्ट शीर्ष पर हो और माइक्रोस्कोप लेंस के निकटतम हो ।
   6. पीएनएस चोट के लिए, लार्वा पृष्ठीय पक्ष को ऊपर रखें, ताकि दोनों श्वासनली दिखाई दें। फिर कक्षा III दा न्यूरॉन एक्सॉन(चित्रा 1बी और 1 सी), चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन एक्सॉन (चित्रा 1बी और 1E) को घायल करने के लिए 90 डिग्री, या चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन डेंजर (चित्रा2ए)को घायल करने के लिए ~ 30 डिग्री घायल करने के लिए बाईं ओर लार्वा ~30डिग्री रोल करें।
   7. सीएनएस चोट के लिए, लार्वा को पूरी तरह से वेंट्रल साइड अप(चित्रा 3ए)की स्थिति में रखें, ताकि ब्याज का क्षेत्र जेड-प्लेन में माइक्रोस्कोप लेंस के सबसे करीब हो।
3. दो फोटॉन लेजर द्वारा चोट
   1. स्लाइड को माइक्रोस्कोप के नीचे लार्वा के साथ रखें और इसे स्टेज पर स्लाइड होल्डर के साथ जगह में सुरक्षित रखें । लार्वा खोजने के लिए 10X (0.3 एनए) उद्देश्य का उपयोग करें।
   2. कवरस्लिप पर उद्देश्य तेल की 1 बूंद जोड़ें, 40X (1.3 एनए) उद्देश्य पर स्विच करें और फोकस को समायोजित करें।
   3. स्कैनिंग मोड पर स्विच करें और प्रायोगिक प्रोटोकॉल 2पी जीएफपी 930 एब्लेशन कापुन: उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि पिनहोल सभी तरह से खोला गया है।
      नोट: विन्यास को व्यक्तिगत प्रणालियों के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता है।
   4. ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र का पता लगाने के लिए लाइव मोड शुरू करें, और उचित ज़ूम के साथ अच्छी छवि गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए सेटिंग्स को ठीक करें।
      नोट: इस कदम का उद्देश्य सबसे अच्छी गुणवत्ता वाली छवि लेने के बजाय घायल होने के लिए न्यूरॉन/एक्सॉन/डेंड्राइट को ढूंढना है । इसलिए, ओवरएक्सपोजर या फोटोब्लैचिंग से बचने के लिए, लक्ष्य क्षेत्र की कल्पना करने के लिए पर्याप्त न्यूनतम सेटिंग्स का उपयोग करें।
   5. लाइव स्कैन बंद करो, ताकि फसल बटन उपलब्ध हो जाएगा। अभी भी छवि रोडमैप के रूप में सेवा करते हैं । फसल समारोह का चयन करें और घायल होने के लिए लक्ष्य पर ध्यान केंद्रित करने के लिए स्कैन विंडो समायोजित करें।
   6. चोट के संभावित स्थल का आकार होने के लिए आरओआई को कम करें। उदाहरण के लिए, चोट की सटीकता सुनिश्चित करने और पड़ोसी ऊतकों को नुकसान को कम करने के लिए, सिर्फ एक अक्षतंप या एक डेंड्राइट की चौड़ाई को कवर करें। यदि वांछित है, तो फसल से पहले आरओआई पर ज़ूम इन करें, जिससे अधिक सटीक चोट के लिए अनुमति दी जा सकती है।
   7. एक नई इमेजिंग विंडो खोलें। स्कैन की गति को कम करें और लेजर तीव्रता बढ़ाएं। लाइव मोड में स्कैन किए गए ऊतक फ्लोरेसेंस सिग्नल के आधार पर लेजर तीव्रता में वृद्धि का निर्धारण करें।
   8. आमतौर पर, दो फोटॉन लेजर तीव्रता पीएनएस चोट के लिए 25% से शुरू और वीएनसी चोट के लिए 50-100% सेट करें । पीएनएस एक्सॉन इंजरी के लिए यह सुनिश्चित करें कि लेजर की तीव्रता ~480 मीटर और पिक्सल वेट वेल समय 8.19 माइक्रोन है। वीएनसी एक्सॉन चोट के लिए, यह सुनिश्चित करें कि लेजर तीव्रता और पिक्सेल निवास समय आमतौर पर क्रमशः 965-1930 मिलियन और 8.19-32.77 माइक्रोन हैं।
   9. लगातार स्कैन शुरू करें। कर्सर को निरंतर बटन पर मंडराते हुए छोड़ दें। छवि पर पैनी नजर रखें और जैसे ही फ्लोरेसेंस में भारी वृद्धि देखी जाती है, स्कैन बंद कर दें।
      नोट: फ्लोरेसेंस स्पाइक की उपस्थिति चोट स्थल पर ऑटो फ्लोरेसेंस के कारण होती है।
   10. सेटिंग्स को फिर से इसयूज करके लाइव मोड पर वापस स्विच करें। ब्याज के उस क्षेत्र का पता लगाएं जिसे सिर्फ फोकस को एडजस्ट करके निशाना बनाया गया था ।
       नोट: सफल चोट का एक अच्छा संकेत चोट स्थल पर एक छोटे से गड्ढा, अंगूठी की तरह संरचना, या स्थानीयकृत मलबे की उपस्थिति है।
   11. अगले न्यूरॉन के लिए ले जाएँ और चरण 1.3.5 से दोहराने के लिए, एक ही जानवर में कई न्यूरॉन्स घायल करने के लिए। या दोहराने कदम १.३.५ जबकि धीरे से शक्ति में वृद्धि और/या स्कैन गति को कम करने अगर प्रारंभिक चोट अपर्याप्त था ।
       नोट: मामले में है कि लेजर शक्ति बहुत अधिक है, एक बड़ा क्षतिग्रस्त क्षेत्र के बाद चोट लाइव स्कैन छवि में दिखाई देगा । बहुत ज्यादा चोट लगने से लार्वा की मौत हो सकती है।
   12. कवरस्लिप को ध्यान से हटाकर लार्वा को ठीक करें और घायल लार्वा को खमीर पेस्ट के साथ एक नई प्लेट पर स्थानांतरित करें। संदंश के साथ आगर प्लेट पर कई गुफाओं खाई; वैकल्पिक रूप से, प्लेट से बाहर रेंगने वाले लार्वा की संभावना को कम करने के लिए, पूरी प्लेट का उपयोग करने के बजाय प्लेट में आगर का एक द्वीप बनाएं।
   13. कमरे के तापमान या 25 डिग्री सेल्सियस पर गीले ऊतक (0.5% प्रोपियोनिक एसिड समाधान के साथ भिगोया) और संस्कृति के साथ 60-मिमी पेट्री डिश में प्लेट रखें।
       नोट: लार्वा 25 डिग्री सेल्सियस की तुलना में कमरे के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) पर लगभग एक अतिरिक्त दिन के लिए लार्वा चरण में रहेगा।
4. चोट के बाद कॉन्फोकल इमेजिंग
   1. संज्ञाहरण की एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर लार्वा तैयार करके और चरण 1.2 में बढ़ते हुए लार्वा तैयार करके वांछित समय बिंदुओं पर घायल लार्वा छवि, फिर कॉन्फोकल लेजर के साथ इमेजिंग।
      नोट: एक्सोनल इंजरी की पुष्टि करने के लिए चोट के बाद 24 घंटे (एआई) पर लार्वा छवि और पुनर्जनन का आकलन करने के लिए 48 एच एआई (चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन्स) या 72 एच एआई (कक्षा III दा न्यूरॉन्स) पर।
   2. 10X उद्देश्य का उपयोग करके लार्वा का पता लगाएं, फिर 25X (0.8 एनए) उद्देश्य पर स्विच करें। प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल जीएफपी इमेजिंग कापुन: उपयोग करें ।
   3. लाइव बटन पर क्लिक करें और पहले एक ही न्यूरॉन घायल लगता है ।
   4. लाइव स्कैन विंडो में पहली और आखिरी जेड पोजीशन सेट करें। एक जेड-स्टैक छवि प्राप्त करने के लिए स्टॉप और स्टार्ट प्रयोग पर क्लिक करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि छवियों को कैप्चर करते समय एक सामान्यीकरण बिंदु (एक्सॉन कन्वर्जिंग पॉइंट) शामिल किया गया है ताकि पुनर्जनन का मात्राकरण संभव हो(चित्र 1डी, 1F)- इस पर डेटा विश्लेषण अनुभाग में आगे चर्चा की जाती है।
   5. इमेज प्रोसेसिंगपर स्विच करें, अभी ली गई छवि का चयन करें, और अधिकतम तीव्रता का अनुमान उत्पन्न करें। जेड-स्टैक और अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवियों दोनों को बचाएं।

Representative Results

चित्रा 1: परिधि में दा न्यूरॉन एक्सॉन पुनर्जनन वर्ग विशिष्टता प्रदर्शित करता है। (एऔर बी) लार्वा की स्थिति को दिखाते हुए योजनाबद्ध ड्राइंग। (ग)तीसरी कक्षा दा न्यूरॉन्स की योजनाबद्ध ड्राइंग। (घ)कक्षा III दा न्यूरॉन्स डीडीएएफ के एक्सॉन, 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, रेपो-Gal80/+, के साथ लेबल, regrow करने में विफल । (ई)चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन्स की योजनाबद्ध ड्राइंग। (एफ)चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन्स v'ada के Axons, ppk-CD4-tdGFP/+, घाव साइट से परे regrow के साथ लेबल । (Dऔर F) लाल रेखा अक्षत की लंबाई को इंगित करती है जबकि हरी धराशायी रेखा कोशिका शरीर और अक्षत अभिसरण बिंदु (डीसीएसी) के बीच की दूरी को चिह्नित करती है। ब्लू डॉट अक्षत अभिसरण बिंदु को चिह्नित करता है। स्केल बार = 20 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें।

चित्रा 2: दा न्यूरॉन डेंड्राइट पुनर्जनन। (A)चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन्स का उदाहरण प्रतिनिधित्व। (ख)कक्षा 4 दा न्यूरॉन डीडीएसी में डेंड्राइट पुनर्जनन का उदाहरण प्रतिनिधित्व, पीपीके-सीडी 4-टीडीजीएफपी/+ द्वारा लेबल किया गया । लेजर एब्लेशन प्राथमिक शाखा बिंदु के लिए लक्षित है और 48 एच एईएल पर आयोजित किया जाता है। न्यूराइट के 24 एच एआई इंजरी ट्रांसेक्शन की पुष्टि होती है, और 72 घंटे में एआई पुनर्जनन की मात्रा निर्धारित की जाती है। डीडीएसी न्यूरॉन्स के डेंड्राइट्स पर्याप्त पुनर्विकास का प्रदर्शन करते हैं, जिसमें खाली जगह को टाइल करने के लिए कटे हुए स्टेम से अंकुरित नई डेंड्रिटिक शाखाएं होती हैं। यह उल्लेखनीय है कि इस विकास के स्तर पर नई टर्मिनल शाखाओं को लगातार घायल डेंजरों में जोड़ा जाता है। स्केल बार = 20 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें।

चित्रा 3: वीएनसी में दा न्यूरॉन एक्सॉन पुनर्जनन। (क)ड्रोसोफिला लार्वा की योजनाबद्ध ड्राइंग एक स्लाइड पर चढ़कर माइक्रोस्कोप के नीचे चित्रित की गई। वीएनसी में चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन एक्सॉन एक ppk-CD4tdGFP/+ लार्वा में कल्पना की । दो उम्मीदवार कॉमिस्योर सेगमेंट को ज़ूम-इन इमेज और योजनाबद्ध ड्राइंग में दिखाया गया है। उनमें से प्रत्येक दो चोट साइटों (लाल हलकों) है । (ख)चोट के बाद 8, 24 और ७२ घंटे (एआई) पर इमेज डे एक घायल सेगमेंट की कॉन्फोकल इमेज । लाल रेखाएं पुनर्विकास अक्षों को दर्शाती हैं। (ग)पुनर्विकास अक्षों का मापन और सामान्यीकरण। स्केल बार = 20 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	59-133
Propionic Acid	J.T.Baker	U33007
Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent