To-foton laserindusert nevral skade: En metode for å observere Axon degenerasjon og regenerering i Drosophila larver

Overview

Denne videoen beskriver to-foton laser ablasjon av axoner i en Drosophila melanogaster larve og et eksempel protokoll for å indusere skade og bilde skadestedet.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Li et al.,A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System, J. Vis. Exp. (2018).

1. To-foton skade og confocal imaging

1. Oppsett av mikroskop
   MERK: Et konfokalt laserskanningsmikroskop med en to-foton laser ble brukt til dette eksperimentet, men andre systemer med tilsvarende oppsett vil også være tilstrekkelig. Den to-foton laser (930 nm) ble brukt til å levere skade og en Argon laser (488 nm) ble brukt til konfekt bildebehandling av GFP.
   1. I begynnelsen av hver økt slår du på tofotonlaseren og/eller den kondole laseren(e) og mikroskopet. Åpne bildebehandlingsprogramvaren.
   2. For to-foton skade, sett opp følgende parametere for avbildning GFP med to-photon laser på 930 nm (1,950 mW).
      1. Velg linjeskanningsmodus. Åpne hullet hele veien. Øk laserintensiteten til ~20 % (390 mW).
      2. Velg 512 x 512 som rammeskanning. Bruk maksimal skannehastighet (vanligvis med pikselens oppholdstid ved 0,77 μs). Kontroller at gjennomsnittstallet er 1 og at bitdybden er 8 biter.
      3. Sett forsterkning til ~750, og forskyvningen til 0.
      4. Lagre denne forhåndsinnstilte eksperimentelle protokollen som 2P GFP 930 Ablation, noe som gir enkel gjenbruk i fremtidige eksperimenter.
   3. For konfektavbildning konfigurerer du følgende parametere for avbildning av GFP med Argon-laseren på 488 nm:
      1. Velg kategorien Anskaffelse og deretter Z-stakk.
      2. Under "Laser", slå på strømmen for 488 nm Argon laser.
      3. Gå til Kanaler, velg 488 mm laser og øk laserstrømmen til 5-10%. For hullet, bruk den 1-2 luftige enheten (AU). Juster forsterkningen til 650.
      4. I anskaffelsesmodusvelger du 1024 x 1024 som rammeskanning, bruker maksimal skannehastighet, et gjennomsnittlig antall 2 og bitdybde på 8 biter.
      5. Lagre denne forhåndsinnstilte eksperimentelle protokollen som GFP Imaging.
2. Larver anestesi med dietyl eter og montering
   1. I en avtrekkshette legger du en 60 mm glassfat i en 15 cm plast Petri-tallerken. Brett og legg et stykke silkepapir på bunnen av glassfatet, og legg deretter en druejuice agarplate på vevet. Tilsett diethyl eter i glassfatet, til det punktet hvor vevspapiret er gjennomvåt og det er et lag med flytende eter igjen i parabolen. Hold lokket på til enhver tid.
   2. Forbered en glasssklie med en dråpe halokarbon 27 olje i midten. Tilsett 4 flekk vakuumfett på de fire hjørnene av lysbildet, for senere å støtte dekslene.
   3. Bruk tang til å plukke opp en rengjort larve og legg den på agarplaten i 60 mm glassfatet. Dekk glassfatet med lokket og vent til larven slutter å bevege seg. For PNS skade / avbildning, ta ut larven så snart halen slutter å rykke. For CNS, vent til hele larven blir ubevegelig, spesielt hodesegmentene.
      MERK: Tidspunktet for etereksponering er kritisk. Se Diskusjon.
   4. Plukk forsiktig opp den bedøvede larven og plasser den hode oppreist i dråpen av halokarbonolje på lysbildet. Legg til en forside på toppen av lysbildet. Bruk forsiktig trykk for å skyve ned på dekslene, til det berører larven (Figur 1A).
   5. Juster larvens posisjon ved å skyve dekslene forsiktig mot venstre eller høyre for å rulle larven, slik at neuron / axon / dendrite av interesse er på toppen og nærmest mikroskoplinsen.
   6. For PNS-skade, monter larvens dorsal side opp, slik at begge tracheas er synlige. Rull deretter larven ~ 30 grader til venstre for å skade klasse III da neuron axons (Figur 1B og 1C), 90 grader for å skade klasse IV da neuron axons (Figur 1B og 1E), eller ~ 30 grader for å skade klasse IV da neuron dendrites (Figur 2A).
   7. For CNS-skade, plasser larven til å være perfekt ventral side opp (Figur 3A), slik at interesseområdet er nærmest mikroskoplinsen i z-flyet.
3. Skade med to-foton laser
   1. Plasser lysbildet med larven under mikroskopet og fest den på plass med glideholderen på scenen. Bruk 10X (0.3 NA) målet for å finne larven.
   2. Tilsett 1 dråpe objektiv olje på dekslene, bytt til 40X (1.3 NA)-målet og juster fokuset.
   3. Bytt til skannemodus og bruk den eksperimentelle protokollen 2P GFP 930 Ablationpå nytt. Pass på at hullhullet er åpnet hele veien.
      MERK: Konfigurasjonen må optimaliseres basert på individuelle systemer.
   4. Start live-modus for å finne interesseområdet (ROI), og finjuster innstillingene for å oppnå god bildekvalitet med riktig zoom.
      MERK: Formålet med dette trinnet er å finne nevron / axon / dendrite å skade, i stedet for å ta bildet av beste kvalitet. Bruk derfor de minimale innstillingene som er tilstrekkelige til å visualisere målområdet, for å unngå overeksponering eller fotobleaching.
   5. Stopp Live-skanning, slik at Beskjær-knappen blir tilgjengelig. La stillbildet fungere som veikart. Velg Beskjær-funksjonen, og juster skannevinduet for å fokusere på målet som skal skades.
   6. Reduser avkastningen for å være størrelsen på det potensielle skadestedet. For eksempel er det bare å dekke bredden på en axon eller en dendrit, for å sikre presisjonen av skaden og redusere skade på nærliggende vev. Hvis ønskelig, zoom inn på avkastningen før beskjæring, noe som gir mer presis skade.
   7. Åpne et nytt bildevindu. Reduser skannehastigheten og øk laserintensiteten. Bestem økningen i laserintensitet basert på vevsfluorescenssignalet skannet i live-modus.
   8. Vanligvis angir du to-foton laserintensitet fra 25% for PNS-skade og 50-100% for VNC-skade. For PNS axonskade må du sørge for at laserintensiteten er ~ 480 mW og pikselboetiden er 8,19 μs. For VNC-axonskaden må du sørge for at laserintensiteten og pikselboetiden vanligvis er henholdsvis 965-1930 mW og 8,19-32,77 μs.
   9. Start kontinuerlig skanning. La markøren holdes over kontinuerlig-knappen. Hold øye med bildet og stopp skanningen så snart en drastisk økning i fluorescens observeres.
      MERK: Utseendet til fluorescensspissen skyldes automatisk fluorescens på skadestedet.
   10. Bytt tilbake til live-modus ved å bruke innstillingene på nytt. Finn interesseområdet som nettopp ble målrettet ved å justere fokuset.
       MERK: En god indikasjon på vellykket skade er utseendet på et lite krater, ringlignende struktur eller lokalisert rusk rett på skadestedet.
   11. Flytt til neste nevron og gjenta fra trinn 1.3.5, for å skade flere nevroner i et enkelt dyr. Eller gjenta trinn 1.3.5 mens du gradvis øker strøm- og/eller reduksjonshastigheten hvis den første skaden ikke var tilstrekkelig.
       MERK: I tilfelle lasereffekten er for høy, vil et stort skadet område være synlig i live scan-bildet etter skade. For mye skade kan forårsake larvens død.
   12. Gjenopprett larven ved å forsiktig fjerne dekslene og overføre den skadede larven til en ny tallerken med gjærpasta. Grøft flere grotter på agarplaten med tang; Alternativt kan du lage en øy av agar i platen i stedet for å bruke hele platen, for å redusere muligheten for at larven kryper ut av platen.
   13. Legg platen i en 60 mm Petri-tallerken med vått vev (gjennomvåt med 0,5% propionsyreoppløsning) og kultur ved romtemperatur eller 25 °C.
       MERK: Larven forblir i larvestadiet i omtrent en ekstra dag ved romtemperatur (22 °C) sammenlignet med ved 25 °C.
4. Konføderering etter skade
   1. Bilde den skadede larven på ønskede tidspunkter ved å forberede larven ved hjelp av samme prosedyre for anestesi og montering som i trinn 1.2, og deretter bildebehandling med den kondokale laseren.
      MERK: Bilde larven på 24 h etter skade (AI) for å bekrefte axonal skade og ved 48 h AI (klasse IV da nevroner) eller 72 h AI (klasse III da nevroner) for å vurdere regenerering.
   2. Finn larven ved hjelp av 10X-målet, og bytt deretter til et 25X (0,8 NA) mål. Bruk den eksperimentelle protokollen GFP Imaging pånytt.
   3. Klikk på Live-knappen og finn den samme nevronen som ble skadet tidligere.
   4. Angi første og siste Z-posisjon i live scan-vinduet. Trykk stopp og klikk Start eksperiment for å få et Z-stack-bilde.
      MERK: Forsikre deg om at et normaliseringspunkt (axonkonvergeringspunktet) er inkludert når du tar bilder slik at kvantifisering av regenerering er mulig (Figur 1D, 1F) - dette diskuteres videre i dataanalysedelen.
   5. Bytt til Bildebehandling, velg bildet som nettopp er tatt, og generer en maksimal intensitetsprojeksjon. Lagre både z-stack og maksimal intensitet projeksjon bilder.

Representative Results

Figur 1: Da neuron axon regenerering i periferien viser klasse spesifisitet. (A og B) Skjematisk tegning som viser larvens posisjon. (C) Skjematisk tegning av klasse III da nevroner. (D) Axons av klassen III da nevroner ddaF, merket med 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+, unnlater å regrow. (E) Skjematisk tegning av klasse IV da nevroner. (F) Axons av klassen IV da nevroner v'ada, merket med ppk-CD4-tdGFP /+, regrow utover lesjon området. (D og F) Rød linje angir axonlengde mens grønn stiplet linje markerer avstanden mellom cellehuset og axonkonvergeringspunktet (DCAC). Den blå prikken markerer axon konvergeringspunktet. Skalalinje = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Da nevron dendrite regenerering. (A) Illustrativ representasjon av klasse IV da nevroner. (B) Illustrativ representasjon av dendritregenerering i klasse IV da neuron ddaC, merket med ppk-CD4-tdGFP/+. Laserablasjon er rettet mot det primære grenpunktet og utføres ved 48 h AEL. Ved 24 h AI skade transeksjon av neuritt er bekreftet, og ved 72 h AI regenerering er kvantifisert. Dendritter av ddaC-nevroner viser betydelig gjenvekst, med nye dendrittiske grener som spirer fra den avskårne stammen for å flislegge det ledige rommet. Det er verdt å merke seg at nye terminalgrener kontinuerlig legges til de uskadede dendrittene på dette utviklingsstadiet. Skalalinje = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Da neuron axon regenerering i VNC. (A) Skjematisk tegning av en Drosophila larve montert på et lysbilde og avbildet under mikroskopet. Klasse IV da neuron axons i VNC visualisert i en ppk-CD4tdGFP / + larve. To kandidatkommissærsegmenter vises i det zoomede bildet og den skjematiske tegningen. Hver av dem har to skadesteder (røde sirkler). (B) Konfokale bilder av ett skadet segment avbildet i 8, 24 og 72 timer etter skade (AI). Røde linjer skildrer de gjenvoksende axonene. (C) Måling og normalisering av gjenvekstaksoner. Skalalinje = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	59-133
Propionic Acid	J.T.Baker	U33007
Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent