Mikroinjection af Drosophila sygeplejerskeceller: En metode til intracellulær levering

Overview

På grund af deres store størrelse og relativt enkle organisation, Drosophila sygeplejerske celler er ideelt egnet til levende celle billeddannelse undersøgelser. Denne video beskriver en mikroinjection metode til udefrakommende forbindelser levering i cellerne, og den fremhævede protokol viser proceduren med fluorescerende oligonukleotid sonder kaldet molekylære beacons (MBs), der anvendes til at visualisere endogene mRNA udskrifter.

Protocol

Denne protokol er uddrag fra Catrina et al., Visualisering og Sporing endogene mRNA'er i Live Drosophila melanogaster Egg Chambers, J. Vis. Exp. (2019).

1. Design af MB'er til live cellebilleddannelse

1. Fold mål-RNA-sekvensen for at forudsige mRNA-målets sekundære struktur ved hjælp af "RNA-formularen" fra mfoldserveren (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
   1. Indsæt/upload målsekvensen i FASTA-format, vælg henholdsvis 5 eller 10 % suboptimalitet (strukturer med en fri foldeenergi inden for henholdsvis 5 eller 10 % af MFE-værdien), og juster det maksimale antal beregnede foldninger i overensstemmelse hermed (f.eks. større for 10 % suboptimalitet).
      BEMÆRK: Inddragelse af suboptimale sekundære strukturer ved udformningen af MB'er gør det muligt at identificere regioner inden for målmRNA, der kan være mere fleksible eller stive end forudset for den minimale struktur for fri energi (MFE), hvilket forbedrer det overordnede design af MB'er, der er egnede til levende cellebilleddannelse.
   2. Vælg et "øjeblikkeligt job" for mRNA-mål på 800 nukleotider (nt) eller et "batchjob" for mRNA-længder mellem 801 og 8.000 nt. Gem filen "ss-count" som en simpel tekstfil.
2. Brug filen "ss-count", der blev hentet i trin 1.1, som input til PinMol-programmet (https://bratulab.wordpress.com/software/) med de ønskede parametre til at designe flere MB'er til mRNA-målet (se selvstudier, der beskriver brugen af PinMol-programmet på https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/).
   1. Bestem de udvalgte MB'ers specificitet ved at udføre BLAST-analyse: Brug "blastn" sammen med den relevante database (f.eks. for oskar mRNA-specifikke MB'er skal du bruge "refseq-rna"-databasen og Drosophila-melanogasterorganismen).
   2. Identificer et vævsspecifikt udtryk for mRNA-mål (f.eks. for oskar mRNA Flybase> Ekspressionsdata med høj overførselshastighed> FlyAtlas Anatomy Microarray eller modENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) og sammenligne med eventuelle positive BLAST hits. Eliminer sonder, der viser >50% kryds-homologi med andre mRNA'er, der også udtrykkes i det pågældende væv/den pågældende celle.
3. Vælg det fluorophore- og quencherpar, der passer til den mikroskopiopsætning, der er tilgængelig til at udføre levende cellebilleddannelse (f.eks. Cy5/BHQ2).

2. MB Syntese, rensning og karakterisering

1. Brug intern syntese og rensning som tidligere beskrevet i Bratu, Metoder i molekylærbiologi (2006)eller tjenester fra kommercielle udbydere til at syntetisere og rense en til fem MB (se ovenfor note) ved hjælp af følgende mærkningsordning: [5'(Fluorophore)-(C3- eller C6-linker)-(2'-O-methyl MB-sekvens)-(Quencher)3']. Rense MB'er ved hjælp af HPLC i omvendt fase, internt eller ved hjælp af den kommercielle udbyders tjenester.
   BEMÆRK: Fosforramiditterne, der anvendes til automatiseret sondesyntese, skal have modifikationen af 2'- O-methyl-ribonukleotid. Man kan også bruge kimærer af vekslende låst-nukleinsyre (LNA) og 2 '-O-methylmodifikationer for at øge stabiliteten af en hybrid mellem en kortere MB og dens mål mRNA.
2. Syntetisere DNA-oligonukleotider, der svarer til rækkefølgen af den målrettede RNA-region og dermed supplerer sonderegionen af MB, til brug i in vitro-karakterisering (se trin 2.3 til 2.5; ovenfor note). Maksimer hybridisering af MB med DNA-oligonukleotid mål efterligne, ved at medtage på hver ende af DNA-målet fire yderligere nukleotider, som findes i målet mRNA sekvens.
   BEMÆRK: En strengere karakterisering af MB's effektivitet for at detektere den målrettede sekvens kan udføres ved hjælp af in vitro syntetiserede RNA-mål i stedet for komplementære DNA-oligonukleotider.
3. Udfør termisk denaturering af MB alene, mål dens smeltetemperatur (Tm), og bekræft, at MB antager den ønskede hårnåleform ved fysiologisk temperatur. Vi har observeret Tm-værdier mellem 60 og 90 °C.
4. Udfør termisk denaturering af MB i nærværelse af DNA-oligonukleotidmålet, og mål MB:DNA-målhybridens Tm, som tidligere beskrevet i Bratu, Methods in Molecular Biology (2006). Der ønskes en Tm mellem 55 og 60 °C for MB:DNA-hybriden.
5. Udfør in vitro hybridiseringsreaktioner med det tilsvarende DNA-oligonukleotidmål, og bestem effektiviteten af MB:DNA hybriddannelse ved fysiologisk temperatur, som tidligere beskrevet i Bratu, Metoder i molekylærbiologi (2006). Hurtig hybridisering kinetik med DNA-målet efterligne ønskes, men MB'er, der ikke viser høj hybridisering effektivitet med DNA-mål kan have en bedre ydeevne med målet mRNA in vitro og / eller in vivo.

3. Dissektion og forberedelse af individuelle ægkamre til mikroinjektion

1. Foder nyklækkede, parrede kvinder i 2-3 dage med frisk gærpasta.
2. Bedøve fluer på en CO₂ pad og ved hjælp af fine pincet (Dumont #5), overføre 1-2 hunner i en dråbe Halocarbon olie 700 på et glas dække slip.
3. Brug et par pincet, orientere fluen med dorsal side op under et stereomikroskop. Dissekere den kvindelige mave ved at lave et lille snit i den bageste ende og forsigtigt klemme par æggestokke ind i olien.
4. Explant æggestokkene på en olie dråbe på en ny coverslip. Hold forsigtigt den ene æggestok med den ene pincet, mens du klemmer de yngste stadier af ovariolen af med den anden pincet. oskar mRNA er aktivt lokaliseret på og efter midten af oogenesis (etaper > 7), og yngre ægkamre (stadier < 7) er vanskeligere at injicere og overlever ikke så længe. Træk langsomt på dækslet slip (med en nedadgående bevægelse), indtil de enkelte ovarioler eller æg kamre er isoleret og justeret lodret. Yderligere adskille enkelt æg kamre ved at fortrænge de uønskede stadier fra ovariole æg kæde.
   BEMÆRK: Sørg for, at individuelt drillede ægkamre ikke flyder i olien, og at de klæber til dækslet. Dette er vigtigt for både vellykket mikroinjection og image erhvervelse.

4. Mikroinjection af MB i sygeplejerske celler ægkamre

1. Forbered MB-løsningen ved hjælp af et molekylært beacon (f.eks. osk2216Cy5) eller en blanding af to MB'er, der er målrettet mod forskellige mRNA'er, og som er mærket med spektralt forskellige fluorophorer (f.eks. osk2216Cy5 og drongo1111Cy3). Brug en koncentration på 200-300 ng/μL hver MB i HybBuffer (50 mM Tris-HCl - pH 7,5, 1,5 mM MgCl₂ og 100 mM NaCl). For en cocktail af fire MB mærket med den samme fluorophore, der er rettet mod det samme mRNA ved 200 ng/μL hver i HybBuffer (f.eks. osk82, osk1236, osk2216). Drej MB-opløsningen ned umiddelbart før indlæsning af nålen til mikroinjektion.
2. Vælg målsætningen. En 40x olie mål anbefales for at finde en passende æg kammer og for at udføre mikroinjection.
3. Monter coverlip med dissekeret ægkammer på mikroskopstadiet. Opdrage målet i fokus position og identificere et æg kammer på en mid-to-late udviklingsstadium, der er korrekt orienteret mod mikroinjection (dvs. med AàP akse vinkelret på nålen spidsen for at give mulighed for nem injektion i en sygeplejerske celle proksimale til oocyt).
4. Lad en nål (kommerciel eller tilberedt i huset) med ~1 μL MB opløsning (se trin 1.1) og tilslut den til mikroinjektoren. For mikroinjektioner i D. melanogasterægkamre orienteres nålen (se materialetabel)i en vinkel <45° til mikroskopstadiet (f.eks. 30°) for at undgå punktering af flere sygeplejerskeceller.
5. Opsæt injektoren med et injektionstryk på 500-1.000 hPa og et kompensationstryk på 100-250 hPa (se materialetabel).
6. Langsomt flytte scenen for at bringe i synsfeltet et område af olie dråbe tomrum af æg kamre.
7. Brug mikromanipulator joystick, forsigtigt sænke nålen i olie dråbe og bringe sin spids i fokus mod periferien af synsfeltet.
8. Udfør en 'ren' funktion for at fjerne luften fra nålespidsen og for at sikre, at der strømmer fra nålen.
9. Bring nålen til hjemmet position og fokusere på ægget kammer, der skal microinjected, derefter bringe nålen tilbage i fokus og placere den nær kanten af ægget kammer.
10. Udfør en finjustering af målets Z-position, således at membranen, der adskiller follikelcellerne fra sygeplejerskeceller, er i fokus.
11. Sæt nålen ind i en sygeplejerskecelle og udfør injektion i 2-5 s.
12. Tag forsigtigt kanylen af og træk den tilbage til hjemmepositionen.
13. Skift målet til den ønskede forstørrelse for billederhvervelse (60-63x eller 100x), fokuser på ægkammeret, og begynd erhvervelsen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrofluorometer	Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon	n/a	Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette	Fireflysci (former Precision Cells Inc.)	701MFL
Dumont #5 tweezer	World Precision Instruments	501985	Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm	VWR	48393-048
Dissecting microscope	Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.	n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad	Genesee Scienific	59-114
Tris-HCL pH 7.5	Sigma-Aldrich	1185-53-1
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7791-18-6
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Spinning disc confocal microscope	Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.	n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera	Hamamatsu	n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator	Eppendorf Inc.	920000037
FemtoJet Microinjector	Eppendorf Inc.	920010504
Injection needle: Femtotips II	Eppendorf Inc.	930000043
Loading tip: 20 μL Microloader	Eppendorf Inc.	930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm	VWR	48393-026; 48393-172
Dry yeast	Any grocery store	n/a
Computer, > 20 GB RAM			Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing