מיקרו-ג'ינגציה של תאי אחות דרוזופילה: שיטה ללידה תאית

Overview

בשל גודלם הגדול וארגון פשוט יחסית, תאי האחות Drosophila מתאימים באופן אידיאלי למחקרי הדמיית תאים חיים. וידאו זה מתאר שיטת microinjection עבור משלוח תרכובות אקסוגני לתוך התאים, ואת הפרוטוקול בהשתתפות מדגים את ההליך עם בדיקות אוליגונוקלאוטיד פלואורסצנטי שנקרא משואות מולקולריות (MBs) המשמשים לדמיין תעתיקים mRNA אנדוגני.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך קטרינה ואח '.,הדמיה ומעקב אחר mRNAs אנדוגני ב חי Drosophila מלנוגאסטר ביצה צ'יימברס, J. Vis. Exp. (2019).

1. עיצוב MBs להדמיית תאים חיים

1. מקפלים את רצף RNA היעד כדי לחזות את המבנה המשני של יעד mRNA באמצעות "טופס RNA" משרת mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
   1. הדבק/העלה את רצף היעד בפורמט FASTA, בחר 5 או 10% תת-אופטימליות (מבנים עם אנרגיה חופשית של קיפול בטווח של 5 או 10% מערך ה- MFE, בהתאמה), והתאם את המספר המרבי של קיפולים מחושבים בהתאם (למשל גדול יותר עבור 10% תת-אופטימליות).
      שים לב: הכללת מבנים משניים תת-אופטימליים בעת תכנון MBs מאפשרת זיהוי של אזורים בתוך mRNA היעד שעשויים להיות גמישים יותר או נוקשים יותר מהצפוי למבנה האנרגיה החופשית המינימלית (MFE) בלבד, המשפר את התכנון הכולל של MBs המתאימים להדמיית תאים חיים.
   2. בחר "עבודה מיידית" עבור מטרות mRNA של 800 נוקלאוטידים (nt), או "משימת אצווה" עבור אורכי mRNA בין 801 ל- 8,000 nt. שמור את הקובץ "ss-count" כקובץ טקסט פשוט.
2. השתמש בקובץ "ss-count" שהושג בשלב 1.1 כקלט עבור התוכנית PinMol (https://bratulab.wordpress.com/software/) עם הפרמטרים הרצויים, כדי לעצב מספר MBs עבור יעד mRNA (ראה הדרכות המתארות את השימוש בתוכנית PinMol https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/).
   1. לקבוע את הספציפיות של MBs נבחרים על ידי ביצוע ניתוח BLAST: להשתמש "blastn" עם מסד הנתונים המתאים (למשל עבור MBS ספציפיים mRNA אוסקר להשתמש במסד הנתונים "refseq-rna" ואת האורגניזם מלנוגאסטר Drosophila).
   2. זהה כל ביטוי ספציפי לרקמות של יעד mRNA (למשל עבור oskar mRNA Flybase> נתוני ביטוי תפוקה גבוהה> FlyAtlas אנטומיה Microarray או modENCODE אנטומיה RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) ולהשוות עם כל להיטי BLAST חיוביים. לחסל בדיקות המראות >50% קרוס-הומולוגיה עם mRNAs אחרים המתבטאים גם ברקמה / תא של עניין.
3. בחר את זוג הפלואורופור והקווינצ'ר המתאים למגדיר המיקרוסקופיה הזמין לביצוע הדמיית תאים חיים (למשל Cy5/BHQ2).

2. סינתזה, טיהור ואפיון של MB

1. השתמש בסינתזה ובטיהור בתוך הבית כמתואר לעיל בבראטו, שיטות בביולוגיה מולקולרית (2006)או שירותים מספקים מסחריים, כדי לסנתז ולטהר אחד עד חמישה MBs (ראה לעיל הערה), באמצעות ערכת התיוג הבאה: [5'(פלואורופור)-(C3 או C6 linker)-(2'-O-methyl MB רצף)-(Quencher).]. טהר MBs באמצעות HPLC הפוך, בבית או באמצעות השירותים של הספק המסחרי.
   שים לב: הפוספורמידיטים המשמשים לסינתזת בדיקה אוטומטית חייבים לבדוק את השינוי של 2'O-מתיל ריבונוקלאוטיד. אפשר גם להשתמש כימרות של חומצה גרעינית נעולה לסירוגין(LNA) ו 2'O -מתיל שינויים כדי להגדיל את היציבות של היברידית בין MB קצר יותר mRNA היעד שלה.
2. לסנתז DNA oligonucleotides התואמים את הרצף של אזור RNA ממוקד ובכך משלימים את אזור הבדיקה של MBs, לשימוש אפיון במבחנה (ראה שלבים 2.3 כדי 2.5; לעיל הערה). למקסם את ההכלאה של MB עם חיקוי היעד DNA-oligonucleotide, על ידי הכללה בכל קצה של יעד ה-DNA ארבעה נוקלאוטידים נוספים, כפי שנמצא ברצף mRNA היעד.
   שים לב: אפיון קפדני יותר של היעילות של MB כדי לזהות את הרצף הממוקד יכול להתבצע באמצעות מטרות RNA מסונתז במבחנה במקום אוליגונוקלאוטידים DNA משלימים.
3. בצע denaturation תרמית של MB לבד, למדוד את טמפרטורת ההיתוך שלה (Tm), ולאשר כי MB מניח את צורת סיכת הראש הרצויה בטמפרטורה פיזיולוגית. ראינו ערכי Tm בין 60 ל 90 °C (60 °F).
4. בצע denaturation תרמית של MB בנוכחות היעד אוליגונוקלאוטידים DNA ולמדוד את MB:DNA היעד היברידית של Tm, כפי שתואר קודם לכן בראטו, שיטות בביולוגיה מולקולרית (2006). Tm בין 55 ל 60 °C (60 °F) רצוי עבור MB:DNA היברידית.
5. בצע תגובות הכלאה במבחנה עם היעד המתאים DNA oligonucleotide, ולקבוע את היעילות של MB:היווצרות היברידית DNA בטמפרטורה פיזיולוגית, כפי שתואר בעבר בראטו, שיטות בביולוגיה מולקולרית (2006). קינטיקה הכלאה מהירה עם חיקוי יעד ה-DNA רצוי, אולם MBs שאינם מראים יעילות הכלאה גבוהה עם מטרות DNA עשוי להיות ביצועים טובים יותר עם mRNA היעד במבחנה ו / או in vivo.

3. ניתוח והכנת תאי ביצה בודדים למיקרו-לינקציה

1. להאכיל נקבות שזה עתה בקעו, הזדווגו במשך 2-3 ימים עם משחת שמרים טריים.
2. הרדמה זבובים על כרית CO_2, באמצעות פינצטה בסדר (Dumont #5), להעביר 1-2 נקבות לתוך טיפה של שמן Halocarbon 700 על תלוש כיסוי זכוכית.
3. באמצעות זוג פינצטה, לכוון את הזבוב עם הצד הגבי למעלה תחת stereomicroscope. לנתח את הבטן הנשית על ידי ביצוע חתך קטן בקצה האחורי בעדינות לסחוט את זוג השחלות לתוך השמן.
4. הסבר את השחלות על טיפת שמן על כיסוי חדש. בעדינות להחזיק שחלה אחת עם פינצטה אחת תוך צביטת את השלבים הצעירים ביותר של ovariole עם פינצטה אחרת. אוסקר mRNA הוא מקומי באופן פעיל ב ואחרי אמצע oogenesis (שלבים > 7), ותאי ביצה צעירים יותר (שלבים < 7) קשה יותר להזריק ולא לשרוד כל עוד. גררו באיטיות את החלקת הכיסוי (עם תנועה כלפי מטה) עד שהאובריולות הבודדות או תאי הביצים מבודדים ומיישרים אנכית. תאים נפרדים עוד יותר ביצה אחת על ידי עקירת השלבים הלא רצויים משרשרת הביצים ovariole.
   שים לב: ודא כי תאי ביצה להקניט בנפרד לא לצוף בשמן, וכי הם לדבוק להחליק את הכיסוי. זה חשוב הן עבור מיקרו-נדיקציה מוצלחת והן לרכישת תמונה.

4. Microinjection של MBs לתוך תאי האחות של תאי ביצה

1. הכן את פתרון MB, באמצעות משואה מולקולרית אחת (למשל osk2216Cy5), או שילוב של שני MBs כי היעד mRNAs שונים אשר מסומנים עם פלואורופורים נפרדים ספקטרלית (למשל osk2216Cy5 ו drongo1111Cy3). השתמש בריכוז של 200-300 ng/μL כל MB ב HybBuffer (50 mM Tris-HCl - pH 7.5, 1.5 mM MgCl₂ ו 100 mM NaCl). עבור קוקטייל של ארבעה MBs שכותרתו עם אותו פלואורופור כי הם מיקוד mRNA אותו ב 200 ng /μL כל HybBuffer (למשל osk82, osk1236, osk2216). סובב את פתרון MB מיד לפני טעינת המחט עבור microinjection.
2. בחר את המטרה. מטרת שמן 40x מומלץ למציאת תא ביצה מתאים לביצוע microinjection.
3. הר את הכיסוי עם תא ביצה מנותח על שלב המיקרוסקופ. העלה את המטרה בתנוחת המיקוד וזיהה תא ביצה בשלב התפתחותי בינוני עד מאוחר, המכוון כראוי למיקרו-אינג'ים (כלומר, עם ציר AàP הניצב לקצה המחט כדי לאפשר הזרקה קלה בתוך תא אחות קרוב לביצית).
4. לטעון מחט (מסחרי או מוכן בבית) עם ~ 1 μL MB פתרון (ראה שלב 1.1) ולחבר אותו microinjector. עבור microinjections בתאי ביצה D. melanogaster, לכוון את המחט (ראה טבלה של חומרים)בזווית <45° לשלב מיקרוסקופ (למשל 30 °) כדי למנוע ניקוב מספר תאים אחות.
5. הגדרת המזרק עם לחץ הזרקה של 500-1,000 hPa ולחץ פיצוי של 100-250 hPa (ראה טבלה של חומרים).
6. לאט לאט להזיז את הבמה כדי להביא בשדה הראייה שטח של השמן טיפת חלל של תאי ביצה.
7. באמצעות מוט ההיגוי micromanipulator, בעדינות להוריד את המחט לתוך טיפת השמן ולהביא את הקצה שלה לפוקוס לכיוון הפריפריה של שדה הראייה.
8. בצע פונקציה 'נקייה' כדי להסיר את האוויר מקצה המחט ולהבטיח שיש זרימה מהמחט.
9. מביאים את המחט לתנוחת הבית ומתמקדים בתא הביצים כדי להיות microinjected, ואז להחזיר את המחט לפוקוס ולמקם אותו ליד קצה תא הביצים.
10. בצע התאמה עדינה של מיקום Z של המטרה כך הממברנה המפרידה בין תאי הזקיק מתאי האחות הוא בפוקוס.
11. הכנס את המחט לתא אחות ולבצע הזרקה עבור 2-5 s.
12. מוציאים בעדינות את המחט ומוחזרים אותה לתנוחת הבית.
13. שנה את המטרה להגדלה הרצויה לרכישת תמונה (60-63x או 100x), התמקד בתא הביצים והתחל ברכישה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrofluorometer	Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon	n/a	Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette	Fireflysci (former Precision Cells Inc.)	701MFL
Dumont #5 tweezer	World Precision Instruments	501985	Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm	VWR	48393-048
Dissecting microscope	Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.	n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad	Genesee Scienific	59-114
Tris-HCL pH 7.5	Sigma-Aldrich	1185-53-1
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7791-18-6
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Spinning disc confocal microscope	Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.	n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera	Hamamatsu	n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator	Eppendorf Inc.	920000037
FemtoJet Microinjector	Eppendorf Inc.	920010504
Injection needle: Femtotips II	Eppendorf Inc.	930000043
Loading tip: 20 μL Microloader	Eppendorf Inc.	930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm	VWR	48393-026; 48393-172
Dry yeast	Any grocery store	n/a
Computer, > 20 GB RAM			Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing