Overview
उनके बड़े आकार और अपेक्षाकृत सरल संगठन के कारण, ड्रोसोफिला नर्स कोशिकाएं आदर्श रूप से लाइव सेल इमेजिंग अध्ययन के लिए अनुकूल हैं। यह वीडियो कोशिकाओं में एक्सोजेनस यौगिकों वितरण के लिए एक माइक्रोइंजेक्शन विधि का वर्णन करता है, और विशेष रुप से प्रदर्शित प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच के साथ प्रक्रिया को दर्शाता है जिसे आणविक बीकन (एमबीएस) कहा जाता है जो अंतर्जात mRNA टेप की कल्पना करने के लिए उपयोग किया जाता है।
Protocol
इस प्रोटोकॉल में कैट्रीना एट अलसे कुछ अंश है, लाइव ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर एग चैम्बर्स, जे विस एक्सपीमें एंडोजेनस एमएचएनएस की कल्पना और ट्रैकिंग की गई है। (2019).
1. लाइव सेल इमेजिंग के लिए आरबीएस का डिजाइन
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एमफोल्ड सर्वर (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form) से "आरएनए फॉर्म" का उपयोग करके एमआरएनए लक्ष्यकी माध्यमिक संरचना की भविष्यवाणी करने के लिए लक्ष्य आरएनए अनुक्रम को मोड़ें।
- फास्टा प्रारूप में लक्ष्य अनुक्रम को पेस्ट/अपलोड करें, 5 या 10% उप-इष्टतमता (एमएफई मूल्य के 5 या 10% के भीतर तह की मुक्त ऊर्जा वाली संरचनाएं क्रमशः चुनें), और तदनुसार गणना तह की अधिकतम संख्या को समायोजित करें (उदाहरण के लिए 10% उप-इष्टतमता के लिए बड़ा)।
नोट: एमबी डिजाइन करते समय उप-इष्टतम माध्यमिक संरचनाओं को शामिल करना लक्ष्य एमआरएनए के भीतर के क्षेत्रों की पहचान के लिए अनुमति देता है जो अकेले न्यूनतम मुक्त ऊर्जा (एमएफई) संरचना के लिए भविष्यवाणी की तुलना में अधिक लचीला या अधिक कठोर हो सकता है, जो लाइव सेल इमेजिंग के लिए अनुकूल एमबीएस के समग्र डिजाइन में सुधार करता है। - 800 न्यूक्लियोटाइड (एनटी) के एमआरएनए लक्ष्यों के लिए "तत्काल नौकरी" चुनें, या 801 और 8,000 एनटी के बीच एमआरएनए लंबाई के लिए "बैच जॉब" चुनें। "एसएस-काउंट" फ़ाइल को सरल टेक्स्ट फ़ाइल के रूप में सहेजें।
- फास्टा प्रारूप में लक्ष्य अनुक्रम को पेस्ट/अपलोड करें, 5 या 10% उप-इष्टतमता (एमएफई मूल्य के 5 या 10% के भीतर तह की मुक्त ऊर्जा वाली संरचनाएं क्रमशः चुनें), और तदनुसार गणना तह की अधिकतम संख्या को समायोजित करें (उदाहरण के लिए 10% उप-इष्टतमता के लिए बड़ा)।
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एमआरएनए लक्ष्य के लिए कई एमबी डिजाइन करने के लिए वांछित मापदंडों के साथ पिनमोल प्रोग्राम(https://bratulab.wordpress.com/software/)के लिए इनपुट के रूप में चरण 1.1 में प्राप्त "एसएस-काउंट" फ़ाइल का उपयोग करें (https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/पर पिनमोल कार्यक्रम के उपयोग का वर्णन करने वाले ट्यूटोरियल देखें)।
- ब्लास्ट विश्लेषण करके चयनित एमबीएस की विशिष्टता निर्धारित करें: उपयुक्त डेटाबेस के साथ "ब्लास्टन" का उपयोग करें (उदाहरण के लिए ओस्कर एमएनए-विशिष्ट एमबी "रेस्सेक-आरएनए" डेटाबेस और ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर जीव का उपयोग करें)।
- एमआरएनए लक्ष्य की किसी भी ऊतक-विशिष्ट अभिव्यक्ति की पहचान करें (उदाहरण के लिए ओस्कर एमआरएनए फ्लाईबेस और जीटी; हाई-थ्रूपुट एक्सप्रेशन डेटा एंड जीटी; फ्लाईएटलास एनाटॉमी माइक्रोरे या मोडएनकोड एनाटॉमी आरएनए-सेक़; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) और किसी भी सकारात्मक ब्लास्ट हिट के साथ तुलना करें। अन्य mRNAs के साथ दिखाने वाले जांच को समाप्त करें जो ब्याज के ऊतक/सेल में भी व्यक्त किए जाते हैं।
- लाइव सेल इमेजिंग (जैसे Cy5/BHQ2) प्रदर्शन करने के लिए उपलब्ध माइक्रोस्कोपी सेट-अप के लिए उपयुक्त फ्लोरोफोर और क्वेंचर जोड़ी का चयन करें।
2. एमबी संश्लेषण, शुद्धि, और लक्षण वर्णन
- ब्रैटू में पहले वर्णित इन-हाउस संश्लेषण और शुद्धि का उपयोग करें, आणविक जीव विज्ञान (2006) में विधियां,या वाणिज्यिक प्रदाताओं से सेवाएं, निम्नलिखित लेबलिंग योजना का उपयोग करके एक से पांच एमबी (ऊपर देखें) को संश्लेषित और शुद्ध करने के लिए: [5'(फ्लोरोफोर) -(C3 या C6 लिंकर) -(2'-O-मिथाइल MB) (Quencher)3']। रिवर्स-फेज एचपीएलसी का उपयोग करके, घर में या वाणिज्यिक प्रदाता की सेवाओं का उपयोग करके एमबीएस को शुद्ध करें।
नोट: स्वचालित जांच संश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले फॉस्फोरमाइडाइट्स में 2'-ओ-मिथाइल राइबोन्यूक्लियोटाइड संशोधन होना चाहिए। एक छोटे एमबी और इसके लक्ष्य एमआरएनए के बीच हाइब्रिड की स्थिरता बढ़ाने के लिए बारी-बारी से लॉक-न्यूक्लिक एसिड (एलएनए) और 2'-ओ-मिथाइल संशोधनों के कल्पना का भी उपयोग कर सकते हैं। - डीएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का संश्लेषण करें जो लक्षित आरएनए क्षेत्र के अनुक्रम से मेल खाते हैं और इस प्रकार एमबीएस के जांच क्षेत्र के पूरक हैं, इन विट्रो लक्षण वर्णन में उपयोग के लिए (चरण 2.3 से 2.5; नोट से ऊपर देखें)। डीएनए-ओलिगोन्यूक्लियोटाइड लक्ष्य नकल के साथ एमबी के संकरण को अधिकतम करें, डीएनए लक्ष्य के प्रत्येक छोर पर चार अतिरिक्त न्यूक्लियोटाइड को शामिल करके, जैसा कि लक्ष्य एमआरएनए अनुक्रम में पाया गया है ।
नोट: लक्षित अनुक्रम का पता लगाने के लिए एमबी की दक्षता का अधिक कठोर लक्षण वर्णन पूरक डीएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के बजाय इन विट्रो संश्लेषित आरएनए लक्ष्यों का उपयोग करके किया जा सकता है। - अकेले एमबी के थर्मल डेनैचेशन करें, इसके पिघलने के तापमान (टीएम) को मापें, और पुष्टि करें कि एमबी शारीरिक तापमान पर वांछित हेयरपिन आकार मानता है। हमने 60 से 90 डिग्री सेल्सियस के बीच टीएम मानों का अवलोकन किया है।
- डीएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड लक्ष्य की उपस्थिति में एमबी के थर्मल डेनैचेशन करें और एमबी को मापें: डीएनए लक्ष्य हाइब्रिड के टीएम, जैसा कि पहले ब्रैटू में वर्णित है, आणविक जीव विज्ञान में विधियां (2006)। एमबी: डीएनए हाइब्रिड के लिए 55 और 60 डिग्री सेल्सियस के बीच एक टीएम वांछित है।
- इसी डीएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड लक्ष्य के साथ विट्रो संकरण प्रतिक्रियाओं में प्रदर्शन करें, और एमबी की दक्षता निर्धारित करें: शारीरिक तापमान पर डीएनए हाइब्रिड गठन, जैसा कि पहले ब्रैटू में वर्णित है, आणविक जीव विज्ञान में विधियां (2006)। डीएनए लक्ष्य नकल के साथ तेजी से संकरण काइनेटिक्स वांछित है, हालांकि एमबीएस जो डीएनए लक्ष्यों के साथ उच्च संकरण दक्षता नहीं दिखाते हैं, का लक्ष्य एमआरएनए इन विट्रो और/या वीवो में बेहतर प्रदर्शन हो सकता है ।
3. विच्छेदन और माइक्रोइंजेक्शन के लिए व्यक्तिगत अंडा कक्षों की तैयारी
- ताजा खमीर पेस्ट के साथ 2-3 दिनों के लिए नए रची, संभोग महिलाओं को खिलाएं।
- एनेस्थेटाइज एक सीओ2 पैड पर मक्खियों और, ठीक चिमटी (ड्यूमोंट #5) का उपयोग करके, 1-2 महिलाओं को एक ग्लास कवर स्लिप पर हेलोकार्बन तेल 700 की एक बूंद में स्थानांतरित करें।
- चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करना, एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे पृष्ठीय पक्ष के साथ फ्लाई को उन्मुख करें। पीछे के छोर पर एक छोटा सा चीरा बनाकर मादा पेट को विच्छेदन करें और धीरे-धीरे अंडाशय की जोड़ी को तेल में निचोड़ें।
- अंडाशय को एक नए कवरस्लिप पर तेल की बूंद पर हटाएं। धीरे से एक चिमटी के साथ एक अंडाशय पकड़ जबकि दूसरे चिमटी के साथ ovariole के सबसे कम उम्र के चरणों से चुटकी । ओस्कर एमआरएनए को सक्रिय रूप से मध्य-ऊजेनेसिस (चरणों और 7) के बाद स्थानीयकृत किया जाता है, और छोटे अंडे के कक्षों (चरणों और एलटी; 7) को इंजेक्ट करना अधिक कठिन होता है और लंबे समय तक जीवित नहीं रहता है। धीरे-धीरे कवर स्लिप (नीचे की ओर आंदोलन के साथ) पर खींचें जब तक कि व्यक्तिगत अंडाशय या अंडे के कक्ष अलग-थलग न हों और खड़ी हो जाएं। इसके अलावा ओवेरिओल अंडे की चेन से अवांछित चरणों को विस्थापित करके एक अंडा कक्षों को अलग करें।
नोट: सुनिश्चित करें कि व्यक्तिगत रूप से छेड़ा अंडा कक्षों तेल में नाव नहीं है, और है कि वे कवर पर्ची का पालन करें । यह सफल माइक्रोइंजेक्शन और इमेज एक्विजेक्शन दोनों के लिए महत्वपूर्ण है।
4. अंडे कक्षों की नर्स कोशिकाओं में एमबीएस के माइक्रोइंजेक्शन
- एमबी समाधान तैयार करें, एक आणविक बीकन (जैसे osk2216Cy5) का उपयोग करके, या दो एमबी का मिश्रण जो विभिन्न mRNAs को लक्षित करता है और जो स्पेक्ट्रली अलग फ्लोरोफोरस (जैसे osk2216Cy5 और drongo1111Cy3) के साथ लेबल किए गए हैं। HybBuffer में प्रत्येक एमबी (50 mM Tris-HCl - पीएच 7.5, 1.5 m M MgCl2 और 100 mM NaCl) में 200-300 एनजी/μL प्रत्येक एमबी की एकाग्रता का उपयोग करें। एक ही फ्लोरोफोर के साथ लेबल किए गए चार एमबीएस के कॉकटेल के लिए जो हाइबबफर (जैसे osk82, osk1236, osk2216) में प्रत्येक 200 एनजी/μL पर एक ही mRNA को लक्षित कर रहे हैं। माइक्रोइंजेक्शन के लिए सुई लोड करने से तुरंत पहले एमबी समाधान को स्पिन करें।
- उद्देश्य का चयन करें। एक उपयुक्त अंडा कक्ष खोजने और माइक्रोइंजेक्शन प्रदर्शन के लिए 40x तेल उद्देश्य की सिफारिश की जाती है।
- माइक्रोस्कोप चरण पर विच्छेदित अंडे के कक्ष के साथ कवरस्लिप माउंट करें। फोकस की स्थिति में उद्देश्य को लाएं और मध्य-से-देर से विकास के चरण में एक अंडे के कक्ष की पहचान करें, जो माइक्रोइंजेक्शन के लिए ठीक से उन्मुख है (यानी, सुई टिप के लिए AàP धुरी लंबवत के साथ एक नर्स सेल समीपस्थ के भीतर आसान इंजेक्शन के लिए अनुमति देने के लिए ओसाइट)।
- ~ 1 μL MB समाधान के साथ एक सुई (वाणिज्यिक या घर में तैयार) लोड करें (चरण 1.1 देखें) और इसे माइक्रोइंजेक्टर से कनेक्ट करें। डी मेलनोगास्टर अंडे कक्षों में माइक्रोइंजेक्शन के लिए, कई नर्स कोशिकाओं को पंचर करने से बचने के लिए एक कोण और लेफ्टिनेंट;45 डिग्री पर एक कोण पर सुई (सामग्री की तालिकादेखें) उन्मुख करें।
- 500-1000 एचपीए के इंजेक्शन दबाव और 100-250 एचपीए के मुआवजे के दबाव के साथ इंजेक्टर सेट-अप (सामग्री की तालिकादेखें)।
- धीरे-धीरे अंडे कक्षों के तेल ड्रॉप शून्य के क्षेत्र को देखने के क्षेत्र में लाने के लिए मंच को स्थानांतरित करें।
- माइक्रोमैनीपुलेटर जॉयस्टिक का उपयोग करके, धीरे-धीरे सुई को तेल की बूंद में कम करें और देखने के क्षेत्र की परिधि की ओर ध्यान केंद्रित करने में अपनी नोक लाएं।
- सुई की नोक से हवा को हटाने और यह सुनिश्चित करने के लिए कि सुई से प्रवाह है, एक 'स्वच्छ' कार्य करें।
- सुई को घर की स्थिति में लाएं और अंडे के कक्ष पर ध्यान केंद्रित करें माइक्रोइंजेक्टेड हो, फिर सुई को वापस ध्यान में लाएं और अंडे के कक्ष के किनारे के पास रखें।
- उद्देश्य की जेड-स्थिति का एक अच्छा समायोजन करें जैसे कि नर्स कोशिकाओं से कूप कोशिकाओं को अलग करने वाली झिल्ली ध्यान में है।
- सुई को नर्स सेल में डालें और 2-5 एस के लिए इंजेक्शन करें।
- धीरे-धीरे सुई निकालें और इसे घर की स्थिति में वापस ले लें।
- छवि अधिग्रहण (60-63x या 100x) के लिए वांछित आवर्धन के उद्देश्य को बदलें, अंडे के चैंबर पर ध्यान केंद्रित करें, और अधिग्रहण शुरू करें।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectrofluorometer | Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon | n/a | Photon counting spectrofluorometer |
| Quartz cuvette | Fireflysci (former Precision Cells Inc.) | 701MFL | |
| Dumont #5 tweezer | World Precision Instruments | 501985 | Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Cover slip No.1 22 mm x 40 mm | VWR | 48393-048 | |
| Dissecting microscope | Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| CO2 fruit fly anesthesia pad | Genesee Scienific | 59-114 | |
| Tris-HCL pH 7.5 | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Spinning disc confocal microscope | Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera | Hamamatsu | n/a | |
| PatchMan NP 2 Micromanipulator | Eppendorf Inc. | 920000037 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf Inc. | 920010504 | |
| Injection needle: Femtotips II | Eppendorf Inc. | 930000043 | |
| Loading tip: 20 μL Microloader | Eppendorf Inc. | 930001007 | |
| Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm | VWR | 48393-026; 48393-172 | |
| Dry yeast | Any grocery store | n/a | |
| Computer, > 20 GB RAM | Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing |
