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Encyclopedia of Experiments

Microinjección de células enfermeras de Drosophila: Un método de parto intracelular

Overview

Debido a su gran tamaño y organización relativamente simple, las células enfermeras de Drosophila son ideales para estudios de imágenes de células vivas. Este video describe un método de microinjección para la entrega de compuestos exógenos en las células, y el protocolo destacado demuestra el procedimiento con sondas de oligonucleótidos fluorescentes llamadas balizas moleculares (MBs) utilizadas para visualizar transcripciones endógenas de ARNm.

Protocol

Este protocolo se extrae de Catrina et al., Visualizando y rastreando mRNAs endógenas en cámaras de huevos Drosophila melanogaster en vivo, J. Vis. Exp. (2019).

1. Diseño de MBs para imágenes de células en vivo

  1. Doble la secuencia de ARN de destino para predecir la estructura secundaria del objetivo de ARNm utilizando el "formulario de ARN" del servidor mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
    1. Pegue/cargue la secuencia de destino en formato FASTA, seleccione 5 o 10% sub-optimización (estructuras con una energía libre de plegado dentro del 5 o 10% del valor MFE, respectivamente), y ajuste el número máximo de plegados calculados en consecuencia (por ejemplo, más grande para un 10% de sub-optimización).
      NOTA: La inclusión de estructuras secundarias sub-óptimas al diseñar MBs permite la identificación de regiones dentro del ARNM objetivo que pueden ser más flexibles o más rígidas que las predichas solo para la estructura de energía libre mínima (MFE), lo que mejora el diseño general de MBs adecuado para imágenes de células vivas.
    2. Seleccione un "trabajo inmediato" para objetivos de ARNM de 800 nucleótidos (nt) o un "trabajo por lotes" para longitudes de ARNM entre 801 y 8.000 nt. Guarde el archivo "ss-count" como archivo de texto simple.
  2. Utilice el archivo "ss-count" obtenido en el paso 1.1 como entrada para el programa PinMol (https://bratulab.wordpress.com/software/) con los parámetros deseados, para diseñar varios MBs para el objetivo de MRNA (consulte tutoriales que describen el uso del programa PinMol en https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/).
    1. Determinar la especificidad de los MBs seleccionados mediante la realización de análisis BLAST: utilice "blastn" con la base de datos adecuada (por ejemplo, para los MBs específicos del ARNM de oskar utilizar la base de datos "refseq-rna" y el organismo Drosophila melanogaster).
    2. Identificar cualquier expresión específica del tejido del objetivo de ARNm (por ejemplo, para oskar mRNA Flybase> Datos de expresión de alto rendimiento> Microarray de Anatomía FlyAtlas o RNA-Seq de Anatomía modENCODE; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) y comparar con cualquier golpe BLAST positivo. Elimine las sondas que muestran >50% de homología cruzada con otros mRNAs que también se expresan en el tejido/célula de interés.
  3. Seleccione el par de flúor y quencher adecuado para la configuración de microscopía disponible para realizar imágenes de células vivas (por ejemplo, Cy5/BHQ2).

2. Síntesis mb, purificación y caracterización

  1. Utilice la síntesis y purificación interna como se describió anteriormente en Bratu, Methods in Molecular Biology (2006)o servicios de proveedores comerciales, para sintetizar y purificar de uno a cinco MBs (ver nota anterior), utilizando el siguiente esquema de etiquetado: [5'(Fluorophore)-(C3 o C6 linker)-(2'-O-metil MB sequence)-(Quencher)3']. Purifique los MBs utilizando HPLC en fase inversa, internamente o utilizando los servicios del proveedor comercial.
    NOTA: Los fosforamiditos utilizados para la síntesis automatizada de sondas deben tener la modificación de ribonucleótido de 2'-O-metilo. También se pueden utilizar quimeras de ácido nucleico cerrado (LNA) y 2'-O-modificaciones metilo para aumentar la estabilidad de un híbrido entre un MB más corto y su ARNm objetivo.
  2. Sintetizar oligonucleótidos de ADN que coinciden con la secuencia de la región de ARN objetivo y, por lo tanto, son complementarios a la región de sonda de los MBs, para su uso en caracterización in vitro (ver pasos 2.3 a 2.5; nota anterior). Maximice la hibridación del MB con el objetivo de oligonucleótido de ADN imitar, incluyendo en cada extremo del objetivo de ADN cuatro nucleótidos adicionales, como se encuentra en la secuencia de ARNm objetivo.
    NOTA: Una caracterización más rigurosa de la eficiencia del MB para detectar la secuencia dirigida se puede realizar utilizando objetivos de ARN sintetizados in vitro en lugar de oligonucleótidos de ADN complementarios.
  3. Realice la desnaturalización térmica del MB solo, mida su temperatura de fusión (Tm) y confirme que el MB asume la forma de horquilla deseada a temperatura fisiológica. Hemos observado valores de Tm entre 60 y 90 °C.
  4. Realizar la desnaturalización térmica del MB en presencia del objetivo de oligonucleótido de ADN y medir el Tm del híbrido objetivo MB:DNA, como se describió anteriormente en Bratu, Methods in Molecular Biology (2006). Se desea un Tm entre 55 y 60 °C para el híbrido MB:DNA.
  5. Realizar reacciones de hibridación in vitro con el objetivo de oligonucleótido de ADN correspondiente, y determinar la eficiencia de mb: formación híbrida de ADN a temperatura fisiológica, como se describió anteriormente en Bratu, Métodos en Biología Molecular (2006). Se desea una cinética de hibridación rápida con el objetivo de ADN imita, sin embargo, los MBs que no muestran una alta eficiencia de hibridación con objetivos de ADN pueden tener un mejor rendimiento con el ARNm objetivo in vitro y/o in vivo.

3. Disección y preparación de cámaras de huevo individuales para microinjección

  1. Alimente hembras recién eclosionadas y apareadas durante 2-3 días con pasta de levadura fresca.
  2. El anestesiado vuela en una almohadilla de CO2 y, usando pinzas finas (Dumont #5), transfiere 1-2 hembras en una gota de aceite de halocarbono 700 en un resbalón de cubierta de vidrio.
  3. Usando un par de pinzas, orientar la mosca con el lado dorsal bajo un estereomicroscopio. Disecciona el abdomen femenino haciendo una pequeña incisión en el extremo posterior y exprime suavemente el par de ovarios en el aceite.
  4. Explanta los ovarios en una gota de aceite en un nuevo cubre coverslip. Sostenga suavemente un ovario con una pinza mientras pellizca las etapas más jóvenes del ovariole con la otra pinza. el ARNm oskar se localiza activamente a mediados y después de la ogénesis media (etapas > 7), y las cámaras de huevos más jóvenes (etapas < 7) son más difíciles de inyectar y no sobreviven tanto tiempo. Arrastre lentamente el resbalón de la cubierta (con un movimiento hacia abajo) hasta que las cámaras individuales o de huevo estén aisladas y alineadas verticalmente. Otras cámaras de huevo individuales separadas desplazando las etapas no deseadas de la cadena de huevos ovariole.
    NOTA: Asegúrese de que las cámaras de huevo burladas individualmente no floten en el aceite, y que se adhieren a la tapadera. Esto es importante tanto para la microinyección exitosa como para la adquisición de imágenes.

4. Microinjeción de MBs en las células enfermeras de las cámaras de huevos

  1. Preparar la solución MB, utilizando una baliza molecular (por ejemplo, osk2216Cy5), o una mezcla de dos MBs que se dirigen a diferentes mRNAs y que están etiquetados con fluoróforos espectralmente distintos (por ejemplo, osk2216Cy5 y drongo1111Cy3). Utilice una concentración de 200-300 ng/μL cada MB en HybBuffer (50 mM Tris-HCl - pH 7.5, 1.5 mM MgCl2 y 100 mM NaCl). Para un cóctel de cuatro MBs etiquetados con el mismo fluoróforo que se dirigen al mismo ARNm a 200 ng/μL cada uno en HybBuffer (por ejemplo, osk82, osk1236, osk2216). Gire hacia abajo la solución MB inmediatamente antes de cargar la aguja para la microinyección.
  2. Seleccione el objetivo. Se recomienda un objetivo de aceite de 40x para encontrar una cámara de huevo adecuada y para realizar la microinyección.
  3. Monte el control de cubierta con cámara de huevo diseccionada en el escenario del microscopio. Plantear el objetivo en la posición de enfoque e identificar una cámara de huevos en una etapa de desarrollo de medio a último tiempo, que está adecuadamente orientada a la microinyección (es decir, con el eje AàP perpendicular a la punta de la aguja para permitir una fácil inyección dentro de una célula enfermera proximal al oocito).
  4. Cargue una aguja (comercial o preparada internamente) con ~1 solución mb de μL (ver paso 1.1) y conéctelo al microinyector. Para microinjecciones en cámaras de huevos D. melanogaster, oriente la aguja (ver Tabla de Materiales)en un ángulo <45° a la etapa del microscopio (por ejemplo, 30°) para evitar perforar varias células enfermeras.
  5. Configurar el inyector con presión de inyección de 500-1.000 hPa y presión de compensación de 100-250 hPa (ver Tabla de Materiales).
  6. Mueva lentamente el escenario para traer en el campo de visión un área del vacío de gota de aceite de las cámaras de huevos.
  7. Usando el joystick micromanipulator, baje suavemente la aguja en la gota de aceite y ponga su punta en el foco hacia la periferia del campo de visión.
  8. Realice una función "limpia" para extraer el aire de la punta de la aguja y para asegurarse de que hay flujo de la aguja.
  9. Lleve la aguja a la posición de casa y concéntrese en la cámara de huevos para que se microinyecte, luego vuelva a enfocar la aguja y colóquela cerca del borde de la cámara de huevos.
  10. Realice un ajuste fino de la posición Z del objetivo de tal manera que la membrana que separa las células folículos de las células enfermeras esté enfocada.
  11. Inserte la aguja en una celda de enfermería y realice la inyección durante 2-5 s.
  12. Retire suavemente la aguja y retírela a la posición de inicio.
  13. Cambie el objetivo a la ampliación deseada para la adquisición de imágenes (60-63x o 100x), concéntrese en la cámara de huevos y comience la adquisición.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrofluorometer Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon n/a Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette Fireflysci (former Precision Cells Inc.) 701MFL
Dumont #5 tweezer World Precision Instruments 501985 Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm VWR 48393-048
Dissecting microscope Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad Genesee Scienific 59-114
Tris-HCL pH 7.5 Sigma-Aldrich 1185-53-1
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 7791-18-6
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Spinning disc confocal microscope Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera Hamamatsu n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator Eppendorf Inc. 920000037
FemtoJet Microinjector Eppendorf Inc. 920010504
Injection needle: Femtotips II Eppendorf Inc. 930000043
Loading tip: 20 μL Microloader Eppendorf Inc. 930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm VWR 48393-026; 48393-172
Dry yeast Any grocery store n/a
Computer, > 20 GB RAM Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing

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