Drosophila Hemşire Hücrelerinin Mikroenjeksiyonu: Hücre İçi Doğum Yöntemi

Overview

Büyük boyutları ve nispeten basit organizasyonları nedeniyle, Drosophila hemşire hücreleri canlı hücre görüntüleme çalışmaları için idealdir. Bu videoda hücrelere eksojen bileşiklerin teslimi için bir mikroenjeksiyon yöntemi açıklanmaktadır ve öne çıkan protokol, endojen mRNA transkriptlerini görselleştirmek için kullanılan moleküler işaretçiler (MB) adı verilen floresan oligonükleotid probları ile prosedürü göstermektedir.

Protocol

Bu protokol Catrina ve ark.,Canlı Drosophila melanogaster Yumurta Odalarında Endojen mRNA'ları Görselleştirme ve İzleme, J. Vis. Exp'ten alıntılanmıştır. (2019).

1. Canlı Hücre Görüntüleme için MB Tasarımı

1. MFOLD sunucusundan(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form)"RNA formunu" kullanarak mRNA hedefinin ikincil yapısını tahmin etmek için hedef RNA sırasını katlayın.
   1. Hedef sırayı FASTA formatında yapıştırın/yükleyin, %5 veya %10 alt optimaliteyi seçin (MFE değerinin %5 veya %10'u içinde serbest katlama enerjisine sahip yapılar) ve hesaplanan maksimum katlama sayısını buna göre ayarlayın (örn. %10 alt optimalite için daha büyük).
      NOT: MBs tasarlarken en uygun alt ikincil yapıların dahil edilmesi, hedef mRNA içinde yalnızca minimum serbest enerji (MFE) yapısı için tahmin edilenden daha esnek veya daha sert olabilecek bölgelerin tanımlanmasını sağlar ve bu da canlı hücre görüntüleme için uygun MBs'lerin genel tasarımını geliştirir.
   2. 800 nükleotid (nt) mRNA hedefleri için bir "acil iş" veya 801 ile 8.000 nt arasındaki mRNA uzunlukları için bir "toplu işlem" seçin. "Ss-count" dosyasını basit metin dosyası olarak kaydedin.
2. MRNA hedefi için birkaç MB tasarlamak için 1.1. adımda elde edilen "ss-count" dosyasını istenen parametrelerle PinMol programı(https://bratulab.wordpress.com/software/)için giriş olarak kullanın (https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/ PinMol programının kullanımını açıklayan öğreticilere bakın).
   1. BLAST analizi yaparak seçilen MB'lerin özgüllüğünü belirleyin: uygun veritabanıyla "blastn" kullanın (örneğin, oskar mRNA'ya özgü MB'ler için "refseq-rna" veritabanını ve Drosophila melanogaster organizmasını kullanın).
   2. mRNA hedefinin dokuya özgü herhangi bir ifadesini tanımlayın (örneğin oskar mRNA Flybase> Yüksek Aktarım Hızı İfade Verileri> FlyAtlas Anatomy Microarray veya modENCODE Anatomy RNA-Seq için; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) ve herhangi bir pozitif BLAST isabetleri ile karşılaştırın. İlgi çekici dokuda/hücrede de ifade edilen diğer mRNA'larla >%50 çapraz homoloji gösteren probları ortadan kaldırın.
3. Canlı hücre görüntülemesi yapmak için mevcut mikroskopi kurulumuna uygun florofor ve quencher çiftini seçin (örneğin Cy5/BHQ2).

2. MB Sentezi, Arınması ve Karakterizasyonu

1. Aşağıdaki etiketleme şemasını kullanarak bir ila beş MB sentezlemek ve arındırmak için Bratu'da, Moleküler Biyolojide Yöntemler'de (2006)veya ticari sağlayıcılardan gelen hizmetlerde açıklandığı gibi şirket içi sentez ve saflaştırma kullanın: [5'(Fluorophore)-(C3 veya C6 bağlayıcı)-(2'-O-metil MB dizisi)-(Quencher)3']. Ters fazlı HPLC kullanarak, şirket içinde veya ticari sağlayıcının hizmetlerini kullanarak MB'leri arındırın.
   NOT: Otomatik prob sentezi için kullanılan fosforamiditler 2'-O-metil ribonükleotid modifikasyona sahip olmalıdır. Ayrıca, daha kısa bir MB ile hedef mRNA arasındaki bir melezin stabilitesini artırmak için alternatif kilitli nükleik asit (LNA) ve 2'-O-metil modifikasyonlarının chimeras'ları da kullanılabilir.
2. Hedeflenen RNA bölgesinin dizisiyle eşleşen ve bu nedenle in vitro karakterizasyonda kullanılmak üzere MB'lerin prob bölgesini tamamlayan DNA oligonükleotidlerini sentezle (bkz. adım 2.3 ila 2.5; yukarıdaki not). HEDEF mRNA dizisinde bulunduğu gibi, DNA hedefinin her iki ucuna dört ek nükleotid dahil larak, DNA-oligonükleotid hedef mimik ile MB'nin hibridizasyonunu en üst düzeye çıkarın.
   NOT: Hedeflenen diziyi tespit etmek için MB'nin verimliliğinin daha titiz bir şekilde nitelendirilmesi, tamamlayıcı DNA oligonükleotidleri yerine in vitro sentezlenmiş RNA hedefleri kullanılarak gerçekleştirilebilir.
3. MB'nin termal denatürasyonunu tek başına gerçekleştirin, erime sıcaklığını (Tm) ölçün ve MB'nin fizyolojik sıcaklıkta istenen saç tokası şeklini aldığını onaylayın. 60 ila 90 °C arasında Tm değerlerini gözlemledik.
4. DNA oligonükleotid hedefinin varlığında MB'nin termal denatürasyonunu gerçekleştirin ve daha önce Bratu' da açıklandığı gibi MB:DNA hedefi melezinin Tm'sini ölçün, Moleküler Biyoloji yöntemleri (2006). MB:DNA melezi için 55 ila 60 °C arasında bir Tm istenir.
5. İlgili DNA oligonükleotid hedefi ile in vitro hibridizasyon reaksiyonları gerçekleştirin ve daha önce Bratu' da açıklandığı gibi fizyolojik sıcaklıkta MB:DNA hibrid oluşumunun verimliliğini belirleyin, Moleküler Biyoloji yöntemleri (2006). DNA hedef mimik ile hızlı hibridizasyon kinetiği istenmek istemektedir, ancak DNA hedefleri ile yüksek hibridizasyon verimliliği göstermeyen MBs, hedef mRNA in vitro ve/veya in vivo ile daha iyi bir performansa sahip olabilir.

3. Mikroenjeksiyon için Bireysel Yumurta Odalarının Diseksiyonu ve Hazırlanması

1. Yeni yumurtadan çıkmış, çiftleşmemiş dişileri taze maya macunu ile 2-3 gün besleyin.
2. Anestezi bir CO₂ pedinde uçar ve ince cımbız (Dumont #5) kullanarak, 1-2 dişiyi cam kapak kaymasında bir damla Halocarbon yağı 700'e aktarın.
3. Bir çift cımbız kullanarak, sineği sırt tarafı stereomikroskop altında yukarı doğru yönlendirin. Arka uçta küçük bir kesi yaparak dişi karnı parçalara ayırın ve yumurtalık çiftini yavaşça yağa sıkın.
4. Yumurtalıkları yeni bir kapakta yağ damlasına ekin. Diğer cımbızla yumurtalığın en genç aşamalarını çimdiklerken bir yumurtalığı bir cımbızla hafifçe tutun. oskar mRNA, orta oogenezde (aşamalar > 7) ve sonrasında aktif olarak lokalizedir ve genç yumurta odalarının (aşamalar < 7) enjekte etmesi daha zordur ve uzun süre hayatta kalmaz. Tek tek yumurtalıklar veya yumurta odaları izole edilene ve dikey olarak hizalanana kadar kapak kaymasını (aşağı doğru bir hareketle) yavaşça sürükleyin. İstenmeyen aşamaları yumurta yumurtası zincirinden ayırarak tek yumurta odalarını daha da ayırın.
   NOT: Ayrı ayrı alay edilen yumurta odalarının yağda yüzmemesini ve kapak kaymasına yapışmasını sağlayın. Bu hem başarılı mikroenjeksiyon hem de görüntü alımı için önemlidir.

4. MBs'nin Yumurta Odalarının Hemşire Hücrelerine Mikroenjeksiyon

1. Mb çözümünü, bir moleküler işaret (örneğin, osk2216Cy5) veya farklı mRNA'ları hedefleyen ve spektral olarak farklı floroforlarla (örneğin osk2216Cy5 ve drongo1111Cy3) etiketlenmiş iki MB'nin bir karışımını kullanarak hazırlayın. HybBuffer'da her MB'de 200-300 ng/μL konsantrasyon kullanın (50 mM Tris-HCl - pH 7.5, 1.5 mM MgCl₂ ve 100 mM NaCl). HybBuffer'da (örneğin osk82, osk1236, osk2216) her biri 200 ng/μL'de aynı mRNA'yı hedefleyen aynı floroforla etiketlenmiş dört MB'lık bir kokteyl için. Mikroenjeksiyon için iğneyi yüklemeden hemen önce MB çözeltisini aşağı çevirin.
2. Hedefi seçin. Uygun bir yumurta odası bulmak ve mikroenjeksiyon yapmak için 40x yağ hedefi önerilir.
3. Kapak kapağını parçalanmış yumurta odası ile mikroskop aşamasına monte edin. Odak pozisyonundaki hedefi getirin ve mikroenjeksiyon için uygun şekilde yönlendirilmiş bir yumurta odasını orta ila geç gelişim aşamasında tanımlayın (yani, bir hemşire hücresi proksimal içinde oosit içine kolay enjeksiyona izin vermek için iğne ucuna dik AàP ekseni ile).
4. ~1 μL MB çözelti ile bir iğne (ticari veya evde hazırlanmış) yükleyin (bkz. adım 1.1) ve mikroenjektöre bağlayın. D. melanogaster yumurta odalarındaki mikroenjections için, birkaç hemşire hücresinin delinmemesiiçin iğneyi (bkz. Malzeme Tablosu) mikroskop aşamasına (örneğin 30°) <45° açıyla yönlendirin.
5. Enjektörü 500-1.000 hPa enjeksiyon basıncı ve 100-250 hPa kompanzasyon basıncı ile ayarlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
6. Görüş alanını yumurta odalarının yağ damlası boşluğunun bir alanını getirmek için sahneyi yavaşça hareket ettirin.
7. Mikromanipülatör joystick'ini kullanarak, iğneyi yavaşça yağ damlasına küçümseyin ve ucunu görüş alanının çevresine doğru odaklayın.
8. İğne ucundaki havayı çıkarmak ve iğneden akış olduğundan emin olmak için 'temiz' bir işlev gerçekleştirin.
9. İğneyi ev konumuna getirin ve mikroenjected yumurta odasına odaklanın, ardından iğneyi tekrar odak noktasına getirin ve yumurta odasının kenarına yakın bir konuma getirin.
10. Hedefin Z pozisyonunun, folikül hücrelerini hemşire hücrelerinden ayıran zarın odakta olacak şekilde ince bir ayarlamasını gerçekleştirin.
11. İğneyi bir hemşire hücresine yerleştirin ve 2-5 sn enjeksiyon yapın.
12. İğneyi yavaşça çıkarın ve ev konumuna geri alın.
13. Hedefi görüntü alımı için istenen büyütmeye (60-63x veya 100x) değiştirin, yumurta odasına odaklanın ve edinime başlayın.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrofluorometer	Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon	n/a	Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette	Fireflysci (former Precision Cells Inc.)	701MFL
Dumont #5 tweezer	World Precision Instruments	501985	Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm	VWR	48393-048
Dissecting microscope	Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.	n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad	Genesee Scienific	59-114
Tris-HCL pH 7.5	Sigma-Aldrich	1185-53-1
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7791-18-6
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Spinning disc confocal microscope	Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.	n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera	Hamamatsu	n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator	Eppendorf Inc.	920000037
FemtoJet Microinjector	Eppendorf Inc.	920010504
Injection needle: Femtotips II	Eppendorf Inc.	930000043
Loading tip: 20 μL Microloader	Eppendorf Inc.	930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm	VWR	48393-026; 48393-172
Dry yeast	Any grocery store	n/a
Computer, > 20 GB RAM			Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing