生产转基因非洲爪蟾限制性内切酶介导的整合和核移植

Summary

这个视频协议演示了用于产生转基因的方法

Abstract

稳定整合到爪蟾基因组克隆的基因产物，是必要的控制表达的时间和地点，在胚胎发育的后期阶段基因表达，并定义如何增强子和启动子调节胚胎中的基因表达。这里展示的协议，可以用来有效地生产转基因爪蟾胚胎。这种转基因的方法包括三个部分：1。精子细胞核分离成年X.蟾睾丸治疗溶血卵磷脂，permeabilizes精子质膜。 2。卵提取物准备，由低速离心此外，钙，造成提取的进展细胞周期相间，和高速离心分离相间细胞质。 3。核移植：细胞核和提取物相结合，与线性质粒DNA限制性内切酶的转基因和少量引进。在很短的反应，鸡蛋中提取部分decondenses精子染色质和限制性内切酶产生的染色体断裂，促进到基因组的基因重组。经处理后的精子核，然后移植到未受精卵。转基因的整合，通常会出现之前的第一等，由此产生的胚胎嵌合胚胎卵裂。没有任何需要繁殖下一代，允许转基因胚胎的新一代高效，快速的启动子和基因功能分析，可以分析这些胚胎。成人X。蟾此过程还通过生殖细胞传播的转基因和可用于产生转基因动物用于多种用途的线。

Protocol

这种转基因方法修改后的版本，最初在¹和^2。

A.精子细胞核的准备

此核的制备方法是改编自美利^3，但蛋白酶抑制剂已被省略，因为它们与干扰卵子与精子细胞核移植的后续发展。分装冷冻于-80 ° C，可使用约6个月移植。

所有的解决方案应准备，并置于冰上开始前的准备。

1. 麻醉1-2成年男性X 。 pithing 蟾 Tricaine浸泡至少20分钟，取出睾丸。
2. 卷纸巾上的睾丸清除血液，血管和脂肪体，60毫米的Petri 1XMMR菜洗一下，并删除任何额外的脂肪体件。小心不要穿刺睾丸，因为这将释放精子。
3. 传输睾丸干60毫米培养皿中浸渍睾丸和钳，直到没有明显的块。浸渍应尽可能彻底完成，获得产量高的核。
4. 添加2mLs冷核准备缓冲区（NPB的; 1X股票）的浸渍，轻轻地吸液管向上和向下。
5. 通过约4水枪浸渍厚度的棉布上一个漏斗，收集到15毫升管（如猎鹰2059）;与NPB的8mLs冲洗盘，并付诸表决通过的棉布冲洗，收集管。带着手套的手挤在纱布收集到管内剩余的液体。
6. 佩莱在10分钟3000转的精子。在4 °彗星在一个适当的管适配器（例如一个Sorvall HB - 4转子或相当于1480克）的水平转头。倒出上清液;添加8mL NPB的管吸管向上和向下与10 mL的吸管重新悬浮颗粒;以上，倒出上清液再次离心。 NPB的1ML平衡至室温，在旋转。
7. 1ML室温下使用1毫升pipetteman提示NPB的悬浮颗粒，加入50μL的10mg/ml的新鲜的溶血卵磷脂，轻轻混匀，孵育5分钟。在室温下。
8. 添加10毫升冷1XNPB 3％牛血清白蛋白管停止反应，溶血卵磷脂，轻轻混匀，10分钟在一个水平转头在3000 RPM和自旋。倒出上清液。治疗溶血卵磷脂颗粒看起来应该稍微半透明（少不透明白色）比前溶血卵磷脂治疗。
9. 倒出上清液，重悬在5毫升冷NPB的0.3％BSA的颗粒，轻轻混匀，在10 mL的吸管，在3000RPM降速为10分钟以上。
10. 弃上清，重悬沉淀的精子存储缓冲区，并转移到1.5 mL管500μL。现在这是您的原子核股票。冰商店，而你检查的原子核的收益率。
11. 要检查的原子核的产量，98精子稀释缓冲液（SDB），1μL核股票和1:100稀释Hoechst公司的股票在1.5ml的Eppendorf管中加入1μl液。混合核股票非常好，使用前取出1μL剃刀削波（或大开放）枪头。混合稀释康体发展局/赫斯特/原子核非常好，允许少量流入室通过毛细作用是改善纽鲍尔hemacytometer。原子核的复合显微镜下计数hemacytometer平方。从一名男性，你应该得到的未经稀释的股票浓度为1 - ^2X10 5细胞/μL此1:100稀释的股票至少100-200计数（X10 ^的 4细胞/ mL） 。如果你的股票是不太集中，让核解决了几个小时，除去上清液，各显神通。离开原子核4 ° C过夜允许甘油渗透到更好的冷冻保存，然后用大孔吸头混合核股票，准备20μL分装，并冻结在液氮中。

B.高速提取物的制备

这种方法是改编自美利³和生产，这将促进局部肿胀和增加精子核染色质decondensation相间的细胞质中提取。提取物可被冻结在小分装于-80 ° C，并在使用前解冻。

1. 3-5天前，注射HCG，成年女性X.总理8-12 蟾由背淋巴囊PMSG注射50 ü。提取准备前的晚上，与500个单位的HCG和2青蛙/ 2公升1XMMR容器注入每个青蛙。由于裂解或激活蛋青蛙可以妥协的提取物的制备，最好是分成对排卵青蛙。
2. 第二天早上，准备和寒意开始之前的准备所有解决方案。轻轻地，手动从每个青蛙驱逐到鸡蛋大Beakers含有1X的MMR。屏幕从每个集装箱的鸡蛋和花斑，裂解或激活的迹象，从程序（可视化在动物半球的色素沉着收缩）省略任何批次的鸡蛋。收集完整的鸡蛋，甚至色素沉着。优良的受精卵也可以收集从1X孕产妇死亡率在青蛙的桶。鸡蛋的总量应超过100毫升，从8-12位女性。
3. 果冻蛋。要做到这一点，尽可能删除尽可能多的孕产妇死亡率，添加少量的半胱氨酸溶液，漩涡鸡蛋。用新鲜的半胱氨酸溶液替换在DE - jellying几次。德果冻每个批次的鸡蛋分开丢弃破损或卵子激活批次。结合其余的鸡蛋。
4. 洗净的鸡蛋与蛋白酶抑制剂的4倍〜35 mL提取缓冲液（预算外）中，然后在25毫升的脑脊液XB的2倍。
5. 收拾鸡蛋：鸡蛋转移到贝克曼ultraclear管。允许定居的鸡蛋。删除尽可能多的CSF - XB。离心机的鸡蛋，一个贝克曼SW 40钛转子（或类似的转子）在1000 rpm〜60秒（150克）4 ° C。删除多余的溶液从盒装鸡蛋的顶部。
6. 粉碎鸡蛋和产生细胞质提取：10,000 RPM（16,000 G）为10分钟，在4 ° C离心鸡蛋鸡蛋应该分成三个层次：，脂质（上），细胞质（中心），和蛋黄（底部）。从每管收集18针头插入针管通过在基地的细胞质层的细胞质层。细胞质转移到一个新的ultraclear贝克曼管上冰。
7. 分离出细胞质的1X终浓度添加蛋白酶抑制剂。 Recentrifuge细胞质中，在10分钟的16000克在4 ° C。收集上文所述的澄清细胞质。期望获得0.75-1毫升细胞质/青蛙。
8. 新增的能源结构样品的提取量的1 / 20。贝克曼TL - 100超速离心机，聚碳酸酯厚壁管转移到细胞质中。管持有约3毫升，并应至少一半为满。
9. 每管添加1个M氯化钙₂到终浓度为0.4 mm。在室温下15分钟的孵育管。这灭活CSF和推入相间的提取物。
10. 平衡管和离心一个贝克曼TL - 100为1.5小时使用一个TLA的100.3转子70,000 RPM（200,000 G）在4超速离心机° C。细胞质内将分馏成四层，从上到下：血脂，细胞质，细胞膜/线粒体，糖原/核糖体。
11. 从每管（如果装入管2-3毫升〜1毫升）取下注射器插入管的顶部，通过脂质层细胞质层。胞内的一小部分转移新鲜管和recentrifuge 70,000 RPM（200,000 G）为20分钟，在4 ° C的样品
12. 分装上清液0.5 mL管分装成25μL。快速冻结，直到使用液氮储存于-80 ° C等分。要确定是否是有效的提取，精子细胞核中提取孵育，并用Hoechst染色，以确定是否明显隆起的原子核（加厚并延长）除了在室温下10分钟内。

C.转基因反应和核转移

重要事项：检查解决方案，设备和青蛙都开始反应前的准备。一旦你开始，你必须进行使用的大致时间表如下所述的反应，因为许多组件不保持稳定> 30分钟。虽然精子细胞核股票放在冰上，转基因反应（稀释和浓缩），应在室温下保存。

1. 女蛙总理。转基因前的晚上，注入若干个（3-5）成年女性青蛙背淋巴囊绒毛膜促性腺激素800单位，获得新鲜，从第二天开始产卵。
2. 当天的转基因过程中，准备或带来温度为转基因所需的解决方案：
   1. 新鲜的半胱氨酸（2.5％），pH8.0 1XMMR。您将需要要使用的那一天几百毫升。
   2. 0.2XMMR 6％聚蔗糖转基因胚胎和0.2XMMR 100微克/毫升庆大霉素（不聚蔗糖）为提高胚胎移植的菜肴和恢复。解决方案不应温度超过18-21℃，应通过转基因胚胎早期分裂提出的温度在16至21℃，因为较高的温度造成不利影响都转基因和胚胎发育的频率。
   3. 解冻和平衡至室温冷冻等分深圳发展银行当天的移植（精液稀释液），解冻的高速提取物对冰和地点，并准备一个100mm的MgCl ₂的解决方案。
   4. 走出日发送琼脂糖注射菜肴和填写MMR /聚蔗糖溶液，并建立和运行前输液泵，以稳定的流量。
   5. 检查女性青蛙正在铺设和鸡蛋的高品质。理想情况下，鸡蛋应该有一个坚定的皮质（保持形状后去jellying）。
3. 成立一个转基因反应：
   1. 轻轻地（使用裁剪枪头）混合的原子核股票，并结合在1.5ml的Eppendorf管：
      4μl原子核（〜4 - 8X10 ⁵原子核）
      2μL线性质粒（100ng/μl）
      在室温下孵育5分钟。
   2. 孵化进展的同时，淡化0.5μL限制性内切酶4.5μlH ₂ O和添加稀释的酶加入1μl18μl深圳发展银行，MgCl ₂的2μL和高速提取物2μL。添加这种混合物的核质粒的反应。孵化10多分钟，膨胀的原子核。
   3. 在此孵化，鸡蛋挤2-3青蛙和半胱氨酸的解决方案，果冻。洗好（5X）1XMMR，并使用大口径吸管转移到每个琼脂糖以及菜含有0.2X孕产妇死亡率4％聚蔗糖的400-500 dejellied鸡蛋。这通常需要10分钟左右，所以一旦蛋菜准备的反应通常是准备来稀释。
   4. 开始一步约15-20分钟后，轻轻地削尖混合反应（核/提取/ DNA），并在室温下添加5μL至150μL康体发展局。在此稀释混合物的原子核是稳定的，约1小时。，而他们不保留，只要在浓混合气时左移植能力。
4. 负载针：准备上​​述宽口枪头轻轻混合稀释后的反应，然后装入针及时，作为核管迅速将落户。回程针，削200μL枪头年底到了一块细聚乙烯管。绘制成枪头的解决方案，然后将其附加的针管，让溶液通过重力进入针或轻轻按下吸管柱塞。
5. 附加针，泵管，并开始细胞核移植。注射应快速，浅，约鸡蛋的质膜垂直，以避免做损害。在血流建议（10nl/sec）速度，保持针在蛋〜0.5秒。你应该在20-30分钟内完成1-2个菜的移植。

注射后，留在16-20 ° C的菜，直到胚胎已达到4-8细胞阶段。远离非裂解邻居排序切割胚胎转移（用玻璃巴斯德吸管小费大约一个鸡蛋的直径相同）0.2XMMR 4％聚蔗糖到一个新的大盘。细分成更小的群体（10-15 / 6孔板胚胎）和文化0.2XMMR（无聚蔗糖）通过早期开发的100微克/毫升庆大霉素裂解胚胎。应检查在原肠胚，任何死亡的胚胎及时清除和媒体的需要更改。

故障排除：

1. 针被堵塞针的解决方案，从流量应在移植明显。如果针可见颗粒物堵塞，更换针头或尝试以消除碎片，裁剪钳尖端，推动解决方案，通过针。
2. 没有切割鸡蛋得到检查，精子细胞核和注射量的稀释适当的针是不是在移植封锁。如果注射量过高时，鸡蛋也可能不切割，而显示变色的色素沉着或损坏。
3. 在原肠胚形成许多胚胎死亡。有几个因素可以提高胚胎存活率：
   1. 照顾，在制备过程中的细胞核和酶反应。 Decondensed原子核是脆弱的，需要使用上述的时间表被移植。不要置于冰上。
   2. 在酶反应和核转移的影响持续精子细胞核的染色体损伤的转基因频率和胚胎的正常发育。细胞核的染色体损伤，提高了转基因效率，但负面影响生存/正常发展。减少或省略限制性内切酶，在酶的潜伏期可以增强正常发展的速度，但可能会降低转基因或引入到胚胎基因组的质粒拷贝数的频率。
   3. 如果后期通过原肠期胚胎的囊胚显示变色或细胞死亡的迹象，它也有可能是用于移植的一种试剂是有毒的鸡蛋。此外，如果卵子s没有有一个坚定的皮质的，他们可能会接受exogastrulation，不能产生正常后原肠期胚胎。
4. 表达转基因胚胎的数量是低的。限制性内切酶的增加量。

代表转基因胚胎的结果

直到从利益的推动者表达是可见的，应提高核转让产生的转基因胚胎。在上面的图1中，肌动蛋白启动子驱动绿色荧光蛋白在这种转基因小蝌蚪的体节的表达。

Discussion

对于每一个转基因构造进行测试，我们一般移植到500-1000鸡蛋核;在这个规模，我们可以产生转基因胚胎的表达每天10个不同的结构，取决于有多少女性是诱导产卵。在这些移植中，约三分之一的鸡蛋切割和60-80％，这些切割胚胎正常继续通过原肠。根据使用条件的反应，这些胚胎的10-50％之间，表达转基因利益。因此，一旦这个过程是在实验室建立的，它有可能为一名工人在一天的不同质粒表达的转基因胚胎的人群。转基因整合到基因组作为一个concatemer（5-35册），所以这种方法也可用于cointegrate到一个以上的单个胚胎在高频率^{（80-90％）4}的基因组不同的基因。

这里描述的转基因方法已经被成功地用于misexpress感兴趣的基因，研究基因调控，并产生胚胎的表达在细胞或利益结构的荧光标记/记者（例如^，4-7） 。转基因已传播到生殖^8。最后，虽然过程是非洲爪蟾在这里使用证明，它也被改编为在相关的二倍体物种，热带爪^蟾 9使用。

Materials

A.Sperm nuclei preparation

Reagents:

1X MMR (2mM CaCl2, 5mM HEPES, pH7.5, 2mM KCl, 1mM MgCl2, 100mM NaCl). 0.1% Tricaine Methanesulfonate (MS222, aminobenzoic acid ethyl ester, Sigma A-5040), 0.1% sodium bicarbonate. Dissolve in water. 2X Nuclear Preparation Butter (NPB). On the day of the sperm nuclei preparation, make up 30 ml of 2X NPB from aliquots of the stock solutions stored frozen: 500 mM sucrose (1.5 M stock), 30 mM HEPES (1M stock; titrate with KOH so that pH 7.7 is at 15 mM), 1 mM spermidine trihydrochloride (Sigma S-2501; 10 mM stock), 0.4 mM spermine tetrahydrochloride (Sigma S-1141; 10 mM stock), 2 mM dithiothreitol (Sigma D-0632; 100 mM stock), 2 mM EDTA (500 mM EDTA, pH 8.0). Use the 2XNPB to make a. 30ml 1X NPB, b. 10ml 1XNPB+3%BSA (fraction V, Sigma A-7906), c. 5ml 1XNPB+0.3%BSA. Lysolecithin: 100 μl of 10 mg/ml L-α-lyso-Lecithin, Egg Yolk (Calbiochem, 440154); dissolve at room temperature just before use. Store solid stock at 20 °C. Discard the stock powder if it becomes sticky. Bovine serum albumin (BSA): 10% (w/v) BSA (fraction V, Sigma A-7906) Make up 5 ml in water on the day of the sperm nuclei preparation. Sperm storage buffer (1ml) 1X NPB, 30% glycerol, 0.3% BSA. Sperm dilution buffer: 250 mM sucrose, 75 mM KCl, 0.5 mM spermidine trihydrochloride, 0.2 mM spermine tetrahydrochloride. Titrate to pH 7.3-7.5 and store 0.5-1 ml aliquots at 20 °C. H–chst No. 33342 (Sigma B-2261): 10 mg/ml stock in dH2O, store in a light tight vessel at 20 °C.

Equipment:

Swinging bucket rotor and centrifuge cheesecloth dissection tools (forceps and scissors) fluorescence microscope funnel gloves hemocytometer needles (26 gauge) paper towels petri dishes (60 mm) pipettes plastic (5 and 10 ml) Pipetman tips (1 ml and 200μl) Syringes (1 ml) tubes (14 ml; Falcon, 2059) tubes microcentrifuge (1.5 ml)

B. Preparation of High Speed Extract

Reagents:

1X Marc's Modified Ringer (MMR): 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.5. Prepare a 10X stock, and adjust pH with NaOH to 7.5. 20X Extract buffer (XB) salt stock: 2 M KCl, 20 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, filter-sterilize and store at 4 °C. Extract buffer (XB; freshly prepared and stored on ice): 1X XB salts, 50 mM sucrose,10mM HEPES (1 M stock, titrated with KOH so that pH is 7.7 when diluted to 15 mM; filter-sterilize, and store in aliquots at 20 °C). Prepare about 100 ml. 2% (w/v) L-Cysteine hydrochloride 1-hydrate: Made up in 1X XB salts before use and titrated to pH 7.8 with NaOH. Prepare about 300 ml. CSF-XB: 1X XB salts, 1 mM MgCl2 (in addition to MgCl2 present in XB salts; final concentration 2 mM), 10 mM HEPES, pH 7.7, 50 mM sucrose, 5 mM EGTA, pH 7.7. Prepare 50 ml. Protease inhibitors: Mixture of leupeptin, chymostatin, and pepstatin, each dissolved to a final concentration of 10 mg/ml in dimethyl sulfoxide (DMSO). Store in small aliquots at 20 °C. 1 M CaCl2. Energy mix: 150 mM creatine phosphate, 20 mM ATP, 20 mM MgCl2. Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG): 100 U/ml PMSG (P.G.600®, Intervet, Inc., 021825). Dissolve in water and stored at 20 °C. Human Chorionic Gonadotropin (HCG): 1000 U/ml HCG (CHORULON®, Intervet, Inc., 057176 ). Dissolve in water and stored at 4 °C.

Equipment:

Xenopus laevis females Needles (18 and 26 gauge) Pasteur pipette wide bore Syringes (1 mL) Tubes, microcentrifuge (0.5 mL) Tubes, thick-wall polycarbonate (Beckman, 349622) Tubes, ultraclear (14 x 95 mm; Beckman, 344060) Ultracentrifuge and rotors (e.g., Beckman TL-100 with rotors SW 40 Ti and TLA-100.3) Beakers for egg collection Buckets or containers for holding female frogs (e.g., 4-L plastic beakers with mesh lids).

C. Nuclear transplantation.

Reagents:

2.5% agarose in 0.1XMMR (for making injection dishes) 2.5% Cysteine in 1XMMR, pH8.0, prepared on the day of use Ficoll 10 mg/ml gentamycin (1000X stock) high speed egg extract (see above) 100 MgCl2 10X MMR (see above) Restriction enzyme (e.g. NotI from New England Biolabs) Sperm dilution buffer (SDB; see above) and sperm nuclei (see above) Human Chorionic Gonadotropin (HCG) as above mineral oil (Sigma, M8410) Linearized plasmid to be introduced as the transgene: Prepare linearized plasmid at a concentration of about 100 ng/μl in sterile, nuclease-free water (we avoid Tris and EDTA-containing buffers, which are somewhat toxic to embryos). The restriction enzyme used to linearize the plasmid d–s not have to be the same as the one used in the nuclear transfer reaction. We usually use NotI for all reactions, regardless of what plasmid is linearized with. Some calibration of the enzyme dilution used in the reaction may be necessary, as too much enzyme can cause adverse effects on post-gastrula development. Plasmid can be purified in several different ways: we usually use the Qiagen Qiaquick PCR purification kit according to the manufacturers directions; purification of a single band from a gel is not necessary. If plasmid is purified using phenol/chloroform extractions and ethanol precipitation, be certain to remove all traces of organics and ethanol.

Equipment:

Agarose dishes for injection: In a 60 mm plastic petri dish, lay a small 35mmX35mm weigh boat on molten 2.5% agarose in water 0.1XMMR to create a depression with an agarose-coated bottom for filling with eggs. Once agarose has hardened, wrap in parafilm and store at 4 °C until use. Make 2-3 dishes in advance for each transgenic reaction you plan to do.

Infusion pump: We use a single syringe infusion pump from Harvard Apparatus, equipped with a 3 cc syringe/needle filled with mineral oil (Sigma M-8410). Blunt the syringe needle tip (to keep it from perforating the tubing) and attach the fine tygon tubing. Run the pump at ~10nl/sec; this assumes that the time the needle is in each egg will be no greater than 1 sec. Pump should be pre-run for several minutes prior to starting transgenesis for the day to assure that the plunger for the syringe is flush with the piston and that steady positive flow of oil out of the tubing is occurring.

Needles for nuclear transfers. Using a micropipette puller, generate needles with long, sloping tips. Clip these with a forcep under a dissecting microscope equipped with an ocular micrometer to obtain an ~80 micron opening with a beveled shape.

Other equipment: Xenopus laevis females, stereomicroscope, incubator, micromanipulator, microinjection needle puller (e.g. Model P-87, Sutter), syringe needles (26 gauge), glass microinjection needles, ocular micrometer for calibrated clipping of microinjection needle tips to 80μm diameter, petri dishes, weigh boats 35mm, Tygon tubing (ID=1/32 in., OD=3/32 in.)