Produktion av Transgena Xenopus laevis Genom begränsning enzymmedierad Integration och Nuclear Transplantation

Summary

Denna video protokoll visar en metod för att skapa transgena

Abstract

Stabil integration av klonade gener produkter till Xenopus genomet är nödvändigt för att styra tid och plats för uttryck, för att uttrycka gener i senare stadier av embryonal utveckling, och för att definiera hur medel och initiativtagare reglera genuttrycket i embryot. Protokollet visade här kan användas för att effektivt producera transgena Xenopus laevis embryon. Detta genmodifiering metod omfattar tre delar: 1. Spermier kärnor är isolerade från vuxna X. laevis testiklar av behandling med lysolecithin som permeabilizes spermierna plasmamembranet. 2. Ägg extrakt bereds av låg hastighet centrifugering, tillägg av kalcium för att orsaka utdraget att gå vidare till interfas av cellcykeln, och en höghastighetscentrifugering att isolera interfas cytosolen. 3. Nuclear transplantation: atomkärnor och extrahera kombineras med linjäriserade plasmid-DNA som skall införas som transgenen och en liten mängd av begränsning enzym. Under en kort reaktionstid, decondenses ägg extrahera delvis spermier kromatin och restriktionsenzymanalys genererar kromosomala pauser som främjar rekombination av transgenen i genomet. Det behandlade spermierna kärnorna är sedan transplanteras in obefruktade ägg. Integration av transgenen sker oftast före den första embryonala klyvning sådan att den resulterande embryona inte chimär. Dessa embryon kan analyseras utan att man behöver rasen till nästa generation, vilket möjliggör effektiv och snabb generering av transgena embryon för analys av promotor och geners funktion. Vuxen X. laevis följd av detta förfarande propagerar också transgenen via könsceller och kan användas för att generera rader av transgena djur för olika ändamål.

Protocol

Modifierade versioner av denna genmodifiering metod ursprungligen som beskrivs i ¹ och ^2.

A. Spermier kärnor förberedelse

Denna kärnor förberedelse metod är anpassad från Murray ^3, men proteashämmare har utelämnats eftersom de störa efterföljande utveckling av ägg transplanteras med spermier kärnor. Alikvoter är frysta vid -80 ° C och kan användas för transplantation för ca 6 månader.

Alla lösningar skall beredas och placeras på is innan du påbörjar beredningen.

1. Bedöva 1-2 vuxna manliga X. laevis genom nedsänkning i Tricaine i minst 20 minuter följt av nackstick, ta bort testiklarna.
2. Rulla testiklarna på en pappershandduk för att ta bort blod, blodkärl och fett kroppen, tvätta dem kortfattat i en 60 mm petriskål innehåller 1XMMR och ta bort eventuella ytterligare bitar av fett kroppen. Se till att inte punktera testiklarna, eftersom det släpper spermier.
3. Överför testiklarna att en torr 60-mm petriskål och upplösta testiklarna med tång tills det inte finns några synliga bitar. Maceration bör göras så noggrant som möjligt för att få hög avkastning av atomkärnor.
4. Lägg 2mls kallt nukleära förberedelse buffert (NPB, 1X från lager) till blöta och försiktigt pipettera upp och ner.
5. Squirt blöta igenom ca 4 tjocklekar cheesecloth på en tratt, samla in ett 15 ml rör (t.ex. Falcon 2059), skölj skålen med 8mLs av NPB och sätta detta spola igenom cheesecloth och samla det i röret. Med handskar på händerna klämma cheesecloth att samla in resterande vätska i röret.
6. Pellets spermierna vid 3000 rpm i 10 min. vid 4 ° C i en svängig hink rotor (t.ex. 1480g i en Sorvall HB-4 rotor eller motsvarande) med lämplig slang adaptrar. Dekantera supernatanten, lägga 8 mL NPB detta röret och pipetten upp och ner med en 10 ml-pipetten på resuspendera pellets, Spin ner igen som ovan och dekantera supernatanten. Jämvikta 1 mL NPB till rumstemperatur under spinn.
7. Resuspendera pelleten i 1 mL rumstemperatur NPB använda en 1 ml pipetteman spetsen, lägga 50μl av 10mg/mL nybakade lysolecithin, blanda försiktigt och inkubera i 5 minuter. vid rumstemperatur.
8. Tillsätt 10 ml kallt 1XNPB 3% BSA till röret för att stoppa lysolecithin reaktionen, blanda försiktigt och spinn ner i 10 min vid 3000 rpm i en svängig hink rotor. Dekantera supernatanten. Den lysolecithin-behandlade pellets bör titta lite mer genomskinlig (mindre ogenomskinlig vit) än det gjorde innan lysolecithin behandling.
9. Dekantera supernatanten och återsuspendera pelleten i 5 ml kallt NPB 0,3% BSA, blanda försiktigt med en 10 ml pipett och spinn i 10 min vid 3000rpm enligt ovan.
10. Dekantera supernatanten och återsuspendera pelleten i 500μl av sperma buffert och överför till en 1,5 ml rör. Detta är nu din kärnor lager. Förvara på is samtidigt som du kontrollerar utbytet av atomkärnor.
11. För att kontrollera avkastningen av atomkärnor, plats 98 l av spermier spädningsbuffert (SDB), 1 l av det nukleära lager och 1μl av 1:100 utspädning av Hoechst aktier i ett 1,5 mL Eppendorf-rör. Blanda den nukleära beståndet mycket bra hjälp av en rakkniv-klippt (eller stor öppning) pipettspetsen strax innan du tar bort 1 l. Blanda den utspädda SDB / Hoechst / kärnor mycket väl och tillåter en liten mängd att flöda in i kammaren av en förbättrad Neubauer hemacytometer av kapillärkraft. Räkna kärnor i en fyrkant av hemacytometer under ett sammansatt mikroskop. Från en hane, bör du få räknas av minst 100-200 (X10 ⁴ celler / ml) för den här 1:100 utspädning av aktier för en outspädd lager koncentration av 1-2x10 ⁵ celler / mikroliter. Om ditt lager är mindre koncentrerad, låt kärnorna nöja sig i flera timmar, ta bort några av supernatanten och berätta. Lämna atomkärnor vid 4 ° C över natten så att glycerol att tränga in bättre frysförvaring, blanda den nukleära beståndet väl med en stor öppning pipettspets, förbereda 20μl alikvoter och frysa i flytande kväve.

B. Beredning av High Speed ​​Utdrag

Denna metod är anpassad från Murray ³ och producerar en interfasen cytosoliskt extrakt som främjar svullnad och delvis kromatin decondensation tillsatt spermier kärnor. Extrakt kan nedfryst i små alikvoter vid -80 ° C och tinas före användning.

1. 3-5 dagar innan HCG injektion, prime 8-12 vuxen hona X. laevis genom att injicera 50 U PMSG i rygg lymfan SAC. Kvällen innan extrakt förberedelser, Injicera varje groda med 500 enheter HCG och placera 2 grodor / behållaren till 2 liter 1XMMR. Sedan en groda med lysering eller aktivera ägg kan äventyra extraktet förberedelser, är det lämpligt att skilja grodor i par för ägglossning.
2. Nästa morgon, förbereda och kyla alla lösningar innan beredningen. Försiktigt, manuellt utesluta ägg från varje groda till stora beakers innehåller 1X MMR. Screen äggen från varje behållare och utelämna alla partier av ägg med tecken på fläckar, lysering eller aktivering (visualiseras genom sammandragning av pigmentering i djurets halvklotet) från förfarandet. Samla obruten ägg med ännu pigmentering. Bra ägg kan också samlas in från 1X MMR i grodan hinkar. Den totala volymen av ägg bör vara> 100 ml från 8-12 honor.
3. De-gelé äggen. För att göra detta, ta bort så mycket MMR som möjligt, tillsätt en liten mängd cystein lösning, och snurra äggen. Ersätt med färska cystein lösning flera gånger under de-jellying. De-gelé varje parti av ägg separat och kasta partier med brott eller ägg aktivering. Kombinera resten av äggen.
4. Tvätta ägg fyra gånger i ~ 35 ml extrakt buffert (XB) och sedan två gånger i 25 ml CSF-XB med proteashämmare.
5. Att packa äggen: överföring äggen i Beckman UltraClear rör. Låt äggen att lösa. Ta bort så mycket CSF-XB som möjligt. Centrifugera ägg med en Beckman SW 40 Ti rotorn (eller liknande rotor) vid 1000 rpm (150 g) för ~ 60 sek vid 4 ° C. Ta bort överflödig lösning från toppen av förpackade ägg.
6. Att krossa ägg och generera cytoplasmiska extrakt: Centrifugera äggen vid 10.000 rpm (16 tusen g) under 10 minuter vid 4 ° C. Äggen bör dela upp i tre skikt: lipid (överst), cytoplasma (mitten) och äggula (underst). Samla cytoplasmiska lagret från varje rör med en 18-gauge nål genom att sätta in nålen genom röret vid basen av de cytoplasmiska lagret. Överför cytoplasman till ett nytt UltraClear Beckman röret på is.
7. Lägg proteashämmare till den isolerade cytoplasman till en slutlig koncentration av 1X. Recentrifuge cytoplasman på 16 tusen g under 10 minuter vid 4 ° C. Samla förtydligas cytoplasman som beskrivs ovan. Räkna med att få 0,75-1 ml cytoplasman / groda.
8. Tillsätt 1 / 20 av extraktet volymen av energimix till provet. Överför cytoplasman i tjockväggiga polykarbonat rör för Beckman TL-100 ultracentrifugen. Rör har om 3 ml vardera och bör vara minst halvfullt.
9. Tillsätt 1 M CaCl ₂ till varje rör till en slutlig koncentration av 0,4 mM. Inkubera rören i 15 min i rumstemperatur. Detta inaktiverar CSF och knuffar extraktet till interfas.
10. Balans rören och centrifugera dem i en Beckman TL-100 ultracentrifugen med en TLA-100,3 rotor på 70 tusen rpm (200.000 g) för 1,5 h vid 4 ° C. Cytoplasman kommer fraktioneras i fyra skikt, uppifrån och ned: lipid, cytosolen, membran / mitokondrier och glykogen / ribosomer.
11. Ta bort cytosoliskt lagret från varje rör (~ 1 ml om 2-3 ml lastades in i röret) genom att sätta in en spruta in i toppen av röret genom lipid lagret. Överför cytosoliskt bråkdel till frisk rör och recentrifuge proverna vid 70.000 rpm (200.000 g) i 20 minuter vid 4 ° C.
12. Alikvotera supernatanten i 25-l alikvoter i 0,5-mL rör. Quick-frysa alikvoter i flytande kväve och förvara vid -80 ° C fram till användning. För att avgöra om extrakt är effektiv, kan spermier kärnor inkuberas i extraktet och färgas med Hoechst för att avgöra om atomkärnor synbart svullna (tjockna och förlänga) inom 10 minuter efter tillägg vid rumstemperatur.

C. genmodifiering reaktion och kärnöverföring

Viktigt: Kontrollera att lösningar, utrustningar och grodor är alla redo innan du börjar en reaktion. När du börjar måste du fortsätta med reaktionen med ungefärlig tidsplan som beskrivs nedan, eftersom många komponenter inte förblir stabil i> 30 minuter. Medan spermierna kärnorna beståndet hålls på is bör genmodifiering reaktioner (både utspädd och koncentrerad) förvaras i rumstemperatur.

1. Prime kvinnliga grodor. Kvällen innan genmodifiering, injicera flera (3-5) vuxna honor groda med 800 enheter HCG i rygg lymfan sac att få nylagda ägg börjar nästa dag.
2. Dagen för genmodifiering förfarandet, förbereda eller väcka temperatur de lösningar som behövs för genmodifiering:
   1. Nybakade cystein (2,5% i 1XMMR, pH8.0). Du kommer att behöva flera hundra milliliter som ska användas den dagen.
   2. 0.2XMMR 6% Ficoll för transplantation rätter och återvinning av transgena embryon och 0.2XMMR 100 mikrogram / ml gentamicin (utan Ficoll) för att höja embryon. Lösningar bör inte vara varmare än 18-21 ° C och transgena embryon bör höjas genom tidiga klyftor vid temperaturer mellan 16 och 21 ° C, eftersom högre temperaturer påverka både frekvensen av genmodifiering och embryonala utvecklingen.
   3. Tina och utjämna till frysta rumstemperatur alikvoter av SDB (spermier spädningsbuffert) för dagens transplantationer, tina den höga hastigheten extrakt och placera på is, och förbereda en 100mm MgCl _2-lösning.
   4. Ut: ee agarosen injektion rätter och fyll med MMR / Ficoll lösning, och upprätta och pre-kör infusionspump för att stabilisera flödet.
   5. Kontrollera att kvinnliga grodor lägger ägg och är av hög kvalitet. Optimalt ska ägg har ett fast cortex (håll form efter de-jellying).
3. Inrätta en genmodifiering reaktion:
   1. Mycket försiktigt (med hjälp av en klippt pipettspets) blanda kärnorna lager och kombineras på ett 1,5 mL Eppendorf-rör:
      4μl atomkärnor (~ 4-8X10 ⁵ kärnor)
      2μl linjäriserade plasmid (100ng/μl)
      Inkubera 5 minuter vid rumstemperatur.
   2. medan inkubation går, späd 0.5μl restriktionsenzym i 4.5μl H ₂ O och lägga 1μl av utspädd enzym till 18μl av SDB, 2μl av MgCl ₂ och 2μl i hög hastighet extrakt. Lägg till denna blandning till kärnan-plasmiden reaktion. Inkubera 10 minuter att svälla kärnan.
   3. Under denna inkubation, pressa ägg 2 till 3 grodor och de-gelé i cystein lösning. Tvätta dem väl (5X) med 1XMMR, och använda ett brett bar pipett överföra 400-500 dejellied ägg till varje agaros bra maträtt som innehåller 0,2 X MMR 4% Ficoll. Det tar vanligtvis omkring 10 minuter, så när äggrätter är beredda att reaktionen är oftast redo att späda ut.
   4. Cirka 15-20 minuter efter påbörjad steg ett, blanda försiktigt reaktionen (atomkärnor / utdrag / DNA) med en klippt spets och tillsätt ca 5μl till 150 l SDB vid rumstemperatur. Kärnor i utspädd blandning är stabila i ca 1 timme., Medan de inte behåller transplantation egenskap lång när kvar i den koncentrerade blandningen.
4. Ladda nålen: blanda den utspädda reaktionen beredd ovan mycket försiktigt med en bred öppning pipettspets, sedan ladda nålen snabbt, som kärnpunkter kommer att bosätta snabbt i röret. Att skjuta upp den nål och placera en bit av fina Tygon slang på slutet av en klippt 200μl pipettspetsen. Rita lösningen i pipettspetsen, fäst sedan slangen till nålen och låt lösningen in nålen genom gravitation eller försiktigt trycka på pipetten kolven.
5. Fäst nålen pumpslang och börja transplantationer av atomkärnor. Injektionerna bör vara snabb, ytlig och ungefär vinkelrätt mot äggets plasmamembranet för att undvika att göra skada. I flödet föreslagit (10nl/sec), hålla nålen i ägget för ~ 0,5 sekunder. Du ska fylla i 1-2 rätter transplantationer inom 20-30 minuter.

Efter injektioner, lämna rätter på 16-20 ° C tills embryon har nått 4-8 cellen scenen. Sortera klyva embryon från sina icke-klyva grannar genom att överföra (med ett glas pasteurpipett med en spets ungefär samma diameter som ett ägg) till ett nytt stort fat med 0.2XMMR 4% Ficoll. Dela upp klyva embryon i mindre grupper (10-15 embryon / brunn av en 6-brunnar) och kultur i 0.2XMMR (ingen Ficoll) 100 mikrogram / ml gentamicin genom tidig utveckling. Embryon ska kontrolleras under gastrulation med någon döende embryon bort snabbt och den förändrade media som behövs.

Felsökning:

1. Nålen är blockerad: lösning flödet från nålen ska vara synliga vid transplantationer. Om nålen blir blockerad av synliga partiklar, byta nålar eller försöker att ta bort skräpet genom att klippa spetsen med en tång och trycka lösning genom nålen.
2. Inga klyva ägg erhålls: kontrollera att spädningar av spermier atomkärnor och injektionsvolym är lämpliga och att nålen inte var blockerad under transplantationen. Om injektionen volymen är för hög, ägg kan inte heller hålla sig och i stället visa missfärgade pigment eller skada.
3. Många embryon dör under gastrulation. Flera faktorer kan öka embryo överlevnad:
   1. ta hand med atomkärnor vid beredning och den enzymatiska reaktionen. Decondensed kärnor är ömtåliga och måste transplanteras med tidsplanen ovan. Inte placera dem på is.
   2. Den kromosomal skada som de spermier kärnor under enzymet reaktionen och kärnöverföring påverkar både frekvensen av genmodifiering och den normala utvecklingen av embryon. Kromosomskador på kärnorna effektiviserar genmodifiering men negativt påverkar överlevnaden / normal utveckling. Minskar eller utelämna restriktionsenzymanalys under enzymet inkubationstiden kan öka graden av normala utvecklingen, men kan minska frekvensen av genmodifiering eller plasmid antalet exemplar förs in i embryot genomet.
   3. Om sena blastula genom gastrula embryon visar tecken på missfärgning eller celldöd är det också möjligt att en reagens som används för transplantationer var toxiska för ägg. Dessutom, om äggs inte har en fast cortex, kan de genomgå exogastrulation och misslyckas med att generera normala efter gastrula embryon.
4. Antalet embryon uttrycka transgenen är låg. Öka mängden restriktionsenzym.

Representant Transgena Embryo Resultat

Transgena embryon till följd av överföring av kärnkraft bör höjas till uttryck från främjare av intresse är synlig. I Figur 1 ovan, kör en muskel aktin promotor uttryck av grönt fluorescerande protein i somites av denna transgena grodyngel.

Discussion

För varje transgena konstruktion som ska testas, transplantation vi i allmänhet kärnor in 500-1000 ägg, i denna skala, kan vi skapa transgena embryon uttrycker upp till 10 olika konstruktioner per dag, beroende på hur många kvinnor lockas att lägga ägg. Av dessa transplantationer, ungefär en tredjedel av äggen klyva och 60-80% av dessa klyva embryon vidare genom gastrulation normalt. Beroende på vilken reaktionen villkor, mellan 10-50% av dessa embryon uttrycker transgenen av intresse. Därför, när detta förfarande är etablerad i laboratoriet, är det möjligt för en arbetare att skapa populationer av transgena embryon som uttrycker ett antal olika plasmider på en enda dag. Transgener integreras i genomet som concatemer (5-35 kopior), så metoden också kan användas för att cointegrate flera olika transgen i genomet av en enda embryo med hög frekvens (80-90%) ^4.

Den genmodifiering metod som beskrivs här har framgångsrikt använts för att misexpress gener av intresse, att studera genreglering, och att skapa embryon som uttrycker en markör / fluorescerande reporter i celler eller strukturer av intresse (till exempel ^4-7). Transgener har fortplantas genom könsceller ^8. Slutligen, även om förfarandet är för användning med Xenopus laevis här, har det också anpassade för användning i den relaterade diploida arter, Xenopus tropicalis ^9.

Materials

A.Sperm nuclei preparation

Reagents:

1X MMR (2mM CaCl2, 5mM HEPES, pH7.5, 2mM KCl, 1mM MgCl2, 100mM NaCl). 0.1% Tricaine Methanesulfonate (MS222, aminobenzoic acid ethyl ester, Sigma A-5040), 0.1% sodium bicarbonate. Dissolve in water. 2X Nuclear Preparation Butter (NPB). On the day of the sperm nuclei preparation, make up 30 ml of 2X NPB from aliquots of the stock solutions stored frozen: 500 mM sucrose (1.5 M stock), 30 mM HEPES (1M stock; titrate with KOH so that pH 7.7 is at 15 mM), 1 mM spermidine trihydrochloride (Sigma S-2501; 10 mM stock), 0.4 mM spermine tetrahydrochloride (Sigma S-1141; 10 mM stock), 2 mM dithiothreitol (Sigma D-0632; 100 mM stock), 2 mM EDTA (500 mM EDTA, pH 8.0). Use the 2XNPB to make a. 30ml 1X NPB, b. 10ml 1XNPB+3%BSA (fraction V, Sigma A-7906), c. 5ml 1XNPB+0.3%BSA. Lysolecithin: 100 μl of 10 mg/ml L-α-lyso-Lecithin, Egg Yolk (Calbiochem, 440154); dissolve at room temperature just before use. Store solid stock at 20 °C. Discard the stock powder if it becomes sticky. Bovine serum albumin (BSA): 10% (w/v) BSA (fraction V, Sigma A-7906) Make up 5 ml in water on the day of the sperm nuclei preparation. Sperm storage buffer (1ml) 1X NPB, 30% glycerol, 0.3% BSA. Sperm dilution buffer: 250 mM sucrose, 75 mM KCl, 0.5 mM spermidine trihydrochloride, 0.2 mM spermine tetrahydrochloride. Titrate to pH 7.3-7.5 and store 0.5-1 ml aliquots at 20 °C. H–chst No. 33342 (Sigma B-2261): 10 mg/ml stock in dH2O, store in a light tight vessel at 20 °C.

Equipment:

Swinging bucket rotor and centrifuge cheesecloth dissection tools (forceps and scissors) fluorescence microscope funnel gloves hemocytometer needles (26 gauge) paper towels petri dishes (60 mm) pipettes plastic (5 and 10 ml) Pipetman tips (1 ml and 200μl) Syringes (1 ml) tubes (14 ml; Falcon, 2059) tubes microcentrifuge (1.5 ml)

B. Preparation of High Speed Extract

Reagents:

1X Marc's Modified Ringer (MMR): 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.5. Prepare a 10X stock, and adjust pH with NaOH to 7.5. 20X Extract buffer (XB) salt stock: 2 M KCl, 20 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, filter-sterilize and store at 4 °C. Extract buffer (XB; freshly prepared and stored on ice): 1X XB salts, 50 mM sucrose,10mM HEPES (1 M stock, titrated with KOH so that pH is 7.7 when diluted to 15 mM; filter-sterilize, and store in aliquots at 20 °C). Prepare about 100 ml. 2% (w/v) L-Cysteine hydrochloride 1-hydrate: Made up in 1X XB salts before use and titrated to pH 7.8 with NaOH. Prepare about 300 ml. CSF-XB: 1X XB salts, 1 mM MgCl2 (in addition to MgCl2 present in XB salts; final concentration 2 mM), 10 mM HEPES, pH 7.7, 50 mM sucrose, 5 mM EGTA, pH 7.7. Prepare 50 ml. Protease inhibitors: Mixture of leupeptin, chymostatin, and pepstatin, each dissolved to a final concentration of 10 mg/ml in dimethyl sulfoxide (DMSO). Store in small aliquots at 20 °C. 1 M CaCl2. Energy mix: 150 mM creatine phosphate, 20 mM ATP, 20 mM MgCl2. Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG): 100 U/ml PMSG (P.G.600®, Intervet, Inc., 021825). Dissolve in water and stored at 20 °C. Human Chorionic Gonadotropin (HCG): 1000 U/ml HCG (CHORULON®, Intervet, Inc., 057176 ). Dissolve in water and stored at 4 °C.

Equipment:

Xenopus laevis females Needles (18 and 26 gauge) Pasteur pipette wide bore Syringes (1 mL) Tubes, microcentrifuge (0.5 mL) Tubes, thick-wall polycarbonate (Beckman, 349622) Tubes, ultraclear (14 x 95 mm; Beckman, 344060) Ultracentrifuge and rotors (e.g., Beckman TL-100 with rotors SW 40 Ti and TLA-100.3) Beakers for egg collection Buckets or containers for holding female frogs (e.g., 4-L plastic beakers with mesh lids).

C. Nuclear transplantation.

Reagents:

2.5% agarose in 0.1XMMR (for making injection dishes) 2.5% Cysteine in 1XMMR, pH8.0, prepared on the day of use Ficoll 10 mg/ml gentamycin (1000X stock) high speed egg extract (see above) 100 MgCl2 10X MMR (see above) Restriction enzyme (e.g. NotI from New England Biolabs) Sperm dilution buffer (SDB; see above) and sperm nuclei (see above) Human Chorionic Gonadotropin (HCG) as above mineral oil (Sigma, M8410) Linearized plasmid to be introduced as the transgene: Prepare linearized plasmid at a concentration of about 100 ng/μl in sterile, nuclease-free water (we avoid Tris and EDTA-containing buffers, which are somewhat toxic to embryos). The restriction enzyme used to linearize the plasmid d–s not have to be the same as the one used in the nuclear transfer reaction. We usually use NotI for all reactions, regardless of what plasmid is linearized with. Some calibration of the enzyme dilution used in the reaction may be necessary, as too much enzyme can cause adverse effects on post-gastrula development. Plasmid can be purified in several different ways: we usually use the Qiagen Qiaquick PCR purification kit according to the manufacturers directions; purification of a single band from a gel is not necessary. If plasmid is purified using phenol/chloroform extractions and ethanol precipitation, be certain to remove all traces of organics and ethanol.

Equipment:

Agarose dishes for injection: In a 60 mm plastic petri dish, lay a small 35mmX35mm weigh boat on molten 2.5% agarose in water 0.1XMMR to create a depression with an agarose-coated bottom for filling with eggs. Once agarose has hardened, wrap in parafilm and store at 4 °C until use. Make 2-3 dishes in advance for each transgenic reaction you plan to do.

Infusion pump: We use a single syringe infusion pump from Harvard Apparatus, equipped with a 3 cc syringe/needle filled with mineral oil (Sigma M-8410). Blunt the syringe needle tip (to keep it from perforating the tubing) and attach the fine tygon tubing. Run the pump at ~10nl/sec; this assumes that the time the needle is in each egg will be no greater than 1 sec. Pump should be pre-run for several minutes prior to starting transgenesis for the day to assure that the plunger for the syringe is flush with the piston and that steady positive flow of oil out of the tubing is occurring.

Needles for nuclear transfers. Using a micropipette puller, generate needles with long, sloping tips. Clip these with a forcep under a dissecting microscope equipped with an ocular micrometer to obtain an ~80 micron opening with a beveled shape.

Other equipment: Xenopus laevis females, stereomicroscope, incubator, micromanipulator, microinjection needle puller (e.g. Model P-87, Sutter), syringe needles (26 gauge), glass microinjection needles, ocular micrometer for calibrated clipping of microinjection needle tips to 80μm diameter, petri dishes, weigh boats 35mm, Tygon tubing (ID=1/32 in., OD=3/32 in.)