Summary
Изоляция взрослых стволовых клеток из мягких тканей опорно-двигательного аппарата на основе соблюдения скорости клеток к колбе.
Abstract
Взрослые стволовые клетки уже давно обсуждается в отношении их применения в регенеративной медицине. Взрослые стволовые клетки породили много шуму для лечения раненых и больных тканей в связи с их впечатляющими возможностями для прохождения нескольких линии дифференциации клеток и их самообновление способности. Самое главное, эти качества сделали их выгодно для использования в аутологичной трансплантации клеток терапии. Текущего протокола представит читателям изменение preplate техники, где мягких тканей опорно-двигательного аппарата, например, сухожилия и мышцы, являются: 1
Protocol
В общем, полное изменение preplate процедура требует 1-2 дней подготовки, 1 неделя выполнения технических процедур, 2-3 дней клеточной идентификации с иммуноцитохимия, и дополнительные 2-3 недели стволовых расширения популяции клеток. Оборудования, необходимого для стволовых клеточных культур аналогичны других систем культуры клеток, который включает настольные центрифуги, СО 2 инкубатора, ламинарный поток тканевой культуры капот и инвертированный микроскоп оснащен флуоресценции и цифровой камеры. Изолированных стволовых клеток также может быть клонирован и может храниться долгосрочный в жидком азоте в течение текущих или будущих 1,2 исследованиях. Все реагенты и материалы, используемые для этой процедуры должны быть стерильными и обрабатывается асептическим.
Шаг 1: подготовка
- Коллаген пальто культуре ткани блюд и фляги: I тип коллагена производные из телячьей кожи (0,1 г на 1 л; Sigma-Aldrich). Пластик для покрытия включает в себя: Т-25 колб, 6 или 12 и тарелки, блюда (60 и 100 мм, BD Falcon), как описано выше 1,2. Осторожно встряхните Пластик каждые полчаса, в течение 4 часов, чтобы гарантировать даже покрытие коллагена. Раствора коллагена затем удаляется. И покрытием Пластик затем высушивают в капюшоне культуре ткани с УФ-светом и капот, как на, для обеспечения стерильности, и, наконец, recapped или покрытые для дальнейшего использования.
- Подготовка культуре клеток среды: 400 мл DMEM (DMEM, высокий уровень глюкозы; Invitrogen), 50 мл Тепло Инактивированная эмбриональной телячьей сыворотки (FBS, Invitrogen), 50 мл лошадиной сыворотки (HS, Invitrogen) и 5 мл куриного эмбриона экстракт (ЦВЕ; Точная химическая компания ), будут отфильтрованы с помощью вакуумного одноразовые 0.22-мкм на 500 мл стерильной системе фильтров (Corning). Стерильные пенициллина / стрептомицина решение (Invitrogen) будет добавлена в конце концов 100 ед / мл. Готовые решения можно хранить при температуре 4 ° С в течение не менее одного месяца. Это решение используется для отделить клетки из колбы, когда расщепление культур или подготовки клеток для трансплантации.
- Разминка решений для мобильных изоляции: следующие реагенты должны быть прогревается до 37 ° C до их использования для сотовых изоляции: буферизацией соли Хэнка Решение (HBSS, Invitrogen), 0,2% (вес / объем) коллагеназы типа XI (Sigma -Aldrich), со средним показателем 3200 коллагена пищеварения единиц на мл HBSS; Dispase 2,4 units/1mL (Invitrogen), 0,5% (вес / объем) трипсина (Invitrogen).
- Стерилизовать хирургическое оборудование на стадии подготовки: Хирургическая процедура требует стерильных хирургических инструментов, в том числе: разных размеров, пинцеты, микро-ножницы, ножницы диафрагмы и / или скальпелем лезвий. Кроме того, 15 и 50-мл полипропиленовые центрифужные пробирки (BD Falcon); сотовый фильтром (размер пор 70 м) (BD Falcon), 18 -, 23 - и 27-иглы (BD PrecisionGlide), а также 10 - или 20-мл стерильные шприцы (BD).
Шаг 2: биопсия тканей, изоляции и механической диссоциации 1-4
Биопсия тканей выполняются под капотом стерильной культуры и включают свежесобранных сухожилий и скелетные мышцы получают из кости или камбаловидной мышцы задних конечностей от мышей дикого типа (Female C57BL/6J, 4-5 недельного возраста или моложе, Джексон лаборатории). Любые видимые соединительной ткани, кровеносных сосудов, и жировой ткани, которые затем удаляются из образцов биопсии. Ткани сухожилия и мышцы, затем тщательно, определенных в рамках хирургического вскрытия микроскопом, чтобы удалить остатки костей и кожи и помещена в блюдо с холодным (4 ° С) HBSS (дополнено добавить 5% FBS). Изолированной ткани затем отдельно размещены на коллаген покрытием блюд, содержащих холодного HBSS и будет фарш (<1х1 мм 3) в грубой суспензии с использованием микро-ножницы и / или скальпелем лезвий.
Шаг 3: Ферментативное переваривание тканей:
Измельченной ткани затем ферментативно диссоциированных через ряд шагов, 2,4,5
- Передача фарш суспензии ткани на отдельные 15-мл пробирки и центрифуги при ~ 3500 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 5 мин.
- Удалить супернатант, промойте HBSS и повторите снова центрифугирования.
- Удалить супернатант, и переварить эти шламы, добавив 10 мл нагретого 0,2% коллагеназы типа XI (Sigma). Инкубировать 60 минут при 37 ° С при непрерывном осторожно покачайте его труб. Кроме того, трясти руками каждые 10 мин.
- Центрифуга и ресуспендируйте этих шламов в 10 мл dispase (2,4 ед / мл, Gibco) решение. Инкубировать 45 минут при 37 ° С, потрясая руками или осторожно покачайте его каждые 10 мин.
- Центрифуга и вновь приостановить эти шламы в 10 мл 0,2% раствора HBSS трипсина. Инкубационный будет меняться в зависимости от степени, в которой отдельные клетки освобождаются от тканей, которые могут быть выполнены с соблюдением подвески под микроскопом. Это не рекомендуют превышать 30 минут при 37 ° С с инверторным труб или осторожно покачайте его каждые 10 мин.
- Центрифуга результате клеткаов и повторно приостанавливать осадок клеток в 10 мл распространения среднего (ТЧ).
- Диссоциируют клеточной суспензии, передавая экстракта через ряд игл. Затем клетки прошли 2 раза через 18G, то 23G, и, наконец 27G иглу.
- Pass клеточного экстракта через 70-мкм ячейки фильтра.
Шаг 4: Preplating для изоляции различных клеточных популяций на основе клеточной адгезии скоростью 1-3
- Центрифуга и ресуспендируйте ячейки гранул в нераспространении Средний.
- Пластина ячейки смесей на коллаген покрытием Т-25 колбу (или 60 мм блюдо) и пометить его как PP1. Клеточной суспензии следует рассматривать как обладающие большим числом ядер преломления и другого мусора под микроскопом.
- Инкубировать при 37 ° С в увлажненной, 5% СО 2 инкубатора в течение 2 часов.
- Передача nonadherent клетки нового коллагена покрытием Т-25 колбу (или 60 мм блюдо) и отметить его как PP2. Добавьте 5 мл PM в пластине помечены PP1. Рано придерживаясь клеток, которые прикрепляются к колбе в основном миофибробластов 3.
- Вернуться колб для инкубатора в течение еще 24 часов, передача nonadherent клетки нового коллагена покрытием Т-25 колбу (или блюдо) и пометить его как PP3. Добавьте 5 мл распространения среды в пластине помечены PP2. Эти присоединения клеток, которые придают этому колбу в основном фибробласты 2,3.
- Вернуться колб для инкубатора и повторить процедуру в другом 24 часа, пока население PP6 создается. Поддерживать каждой группы приостановлено клеток и позволяют им размножаться и рассматривая их регулярно использовать инвертированный микроскоп. PP3-PP4 в основном миобластов в то время как мышечные клетки спутниковой часто видели в основном в PP5 2.
- Большинство медленно придерживаясь клетки обычно придают путем PP6. На данном этапе клетки появляются маленькие, круглые, светло-преломления и очень скудны по количеству и считаются населения стволовых клеток 1,2.
Шаг 5: Выявление и расширение изолированных стволовых клеток
- Изолированных PP6 клетки очень мало, и их необходимо поддерживать в ФБС богатых распространения среднего (20% FBS в DMEM), который изменяется ежедневно. Большинство клеток в культуре PP6 умереть в течение следующих 1-2 недель культивирования, но большие, здоровые PP6 населения, как правило, созданные после еще 1-2 недели расширения. Стволовых клеток, выделенных из мышей высоко выразить стволовых клеток антигена 1 (SCA1), CD34, фетальные киназы печени 1 (Flk1) и другие маркеры стволовых 1,2,6,7, которые могут быть визуализированы с помощью иммуноцитохимического окрашивания. Эти стволовые клетки также обладают несколькими возможностями дифференциации 3,6,8.
- Изолированных клеток сохраняется и расширены на низкой плотности клеток в культуре (12-а блюда в 50-100 клеток / лунку или <20-30% слияния в колбе или блюдо), чтобы избежать дифференциации 1,2. Очень немногие клетки образуют клоны при расширении, и эти клонированные стволовые клетки могут перемещаться на большие распространения времени (ЛТП) для любых других исследований компетенции. Клонированные стволовые клетки также можно хранить в жидком азоте с использованием общих процедур хранения клетка например, ТЧ среде с 10% ДМСО. Сделать числа низкие запасы прохождения стволовых клеток для любых других исследований, до спины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Было признано, что некоторые взрослые ткани содержат множество стволовых клеток. За последние несколько лет обучения, стволовые клетки были обнаружены в мягких тканях опорно-двигательного аппарата, в том числе скелетные мышцы и сухожилия. Этот ток детали протокола процедура, известная как изменение preplate технику, которая была успешно использована в нашей лаборатории, чтобы изолировать взрослых стволовых клеток из сухожилий и скелетных мышцах. Использование измененных preplate методике, описанной выше клетки могут быть разделены на несколько популяций в зависимости от их сцепления характеристики коллагена покрытием колбы (рис. 1). Фибробласты и миофибробластов найдены в тканях быстро придерживаться коллагена покрытием колбы в течение 24-48 часов и первоначально отделены от других клеток в PP1-PP2. Миогенной или эндотелиальные клетки придерживаться коллагена покрытием колбы после длительного периода времени, в течение 48-96 часов (PP3-§ 5), и могут быть собраны и определены их маркеры клеточной поверхности. Позже preplated клетки, 96 часов или более поздняя версия (§ 6), рассматриваются как взрослые стволовые клетки (рис. 2). Конце клетки preplate появляются мелкие, круглые, полупрозрачные в начале их изоляции и может быть дополнительно характеризуется проточной цитометрии или иммуноцитохимии для их выражения стволовых клеток антигена 1 (SCA1), CD34, фетальные киназы печени 1 (Flk1), и другие маркеры стволовых клеток (рис. 3). Изолированных стволовые клетки обладают способностью к самообновлению и экспериментальные исследования продемонстрировали свою multipotency через их дифференциацию в трех зародышевых листков: мезодерма, эктодерма и энтодерма 9. Несколько исследований также показали, что эти стволовые клетки дифференцируются в клетки мезодермы линии в том числе остеоциты, адипоциты, хондроциты, и гемопоэтические клетки 6,8. Другие исследования показали, что взрослые стволовые клетки дифференцируются в линиях эктодермы клетки через их выражения нейронов и глиальных клеток маркеры и их способность улучшить функцию конечности после периферических нервов было повреждено 10. Эти изолированные стволовые клетки взрослых были полезны для восстановления раненых и больных костно-мышечной ткани, и другие связанные в естественных условиях исследования были проведены на других тканях, включая сердце, печень и спинной мозг, а также конкретные медицинские условия, такие как тонкого кишечника и мочевого пузыря подслизистой для лечения стрессового недержания мочи 9.
Рисунок 1.
Рисунок 2.
Рисунок 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы очень благодарен г-жи Хайин Пан и г-н Ян Bellayr за техническую помощь в изолятор для текущего фильма и г-н Кайл Холден и г-н Джонатан Лукас за их помощь на слайде редактирования. Большое спасибо следующий перечень лиц, которые были связаны с развитием методов preplate изменение за последние годы: Др. Бурхан Гарайбу, Baohong Цао, Дизи Бриджит, Томас Р. Пэйн, Aiping Лу, Хайжун Пэн, Хидеки Осима, Бо Цзэн, Xiaodong Му, Kimimasa Tobita, Рон Янковский, Макато Ikezawa. Мы благодарны за техническую помощь от Джеймс Х. Cummins, Райан Pruchnic, Джозеф Feduska, Ребекка С. Schugar, Хайин Пан и Джессика Tebbets. Автор также хотел бы отметить финансовую поддержку этой работы от мышечной дистрофии ассоциации (МДА), Национальный институт здоровья (NIH), министерства обороны (DOD), детской больницы Питтсбурга о UPMC, Департамент ортопедической хирургии и Университета Питтсбурга.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | #11995-073 | |
| FBS | Invitrogen | #10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | #26050-088 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | #CE650T-10 | |
| 100U ml penicillin/streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | #14190-250 | |
| Hank's Buffered Salt Solution | Invitrogen | #24020-117 | |
| Collagenase type XI 0.2%(wt/vol) | Sigma-Aldrich | #C7657 | |
| Dispase2.4U ml | Invitrogen | #17105-041 | |
| Trypsin-EDTA0.5%(wt/vol) (10x;5g liter trypsin (1:250) | Invitrogen | #15400-054 | |
| Collagen for coating flask : Type I collagen derived from calf skin 0.1 g liter | Sigma-Aldrich | #C-9791 | |
| DMSO | Sigma | #D-2650 |
References
- Gharaibeh, B. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).
- Qu-Petersen, Z. Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: potential for muscle regeneration. J Cell Biol. 157, 851-864 (2002).
- Li, Y. &, Huard, J. Differentiation of muscle-derived cells into myofibroblasts in injured skeletal muscle. Am J Pathol. 161, 895-907 (2002).
- Watt, D. J., Lambert, K., Morgan, J. E., Partridge, T. A. &, Sloper, J. C. Incorporation of donor muscle precursor cells into an area of muscle regeneration in the host mouse. J Neurol Sci. 57, 319-331 (1982).
- Lu, A. Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics. Gene Ther. 15, 1116-1125 (2008).
- Lee, J. Y. Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing. J Cell Biol. 150, 1085-1100 (2000).
- Cao, B. The role of receptors in the maturation-dependent adenoviral transduction of myofibers. Gene Ther. 8, 627-637 (2001).
- Cao, B. Muscle stem cells differentiate into haematopoietic lineages but retain myogenic potential. Nat Cell Biol. 5, 640-646 (2003).
- Huard, J. Regenerative medicine based on muscle stem cells. J Musculoskelet Neuronal Interact. 8, (2008).
- Gates, C. B., Karthikeyan, T., Fu, F. &, Huard, J. Regenerative medicine for the musculoskeletal system based on muscle-derived stem cells. J Am Acad Orthop Surg. 16, 68-76 (2008).
