Summary
בידוד גזע בוגרים תאים ברקמות הרכות השלד מבוסס על מהירות הדבקות של התא בקבוק.
Abstract
בתאי גזע בוגרים כבר מזמן דנו לגבי היישום שלהם ברפואה רגנרטיבית. בתאי גזע בוגרים יצרו מידה רבה של התרגשות לטיפול רקמות פצועים וחולים בגלל היכולות המרשימות שלהם לעבור רב השושלת התמיינות תאים ויכולת התחדשות עצמית שלהם. והכי חשוב, התכונות הללו הפכו אותם יתרון לשימוש טיפולים עצמיים השתלת תאים. הפרוטוקול הנוכחי יהיה להכניס את הקוראים לטכניקה preplate שונה שבו הרקמות הרכות של מערכת השלד, שריר גיד למשל ואת, הם 1
Protocol
ככלל, הנוהל המלא preplate שונה דורש 1-2 ימים של הכנות, 1 שבוע של ביצוע הליך טכני, 2-3 ימים של הזדהות עם התא immunocytochemistry, וכן תוספת של 2-3 שבועות הרחבה בתאי גזע האוכלוסייה. הציוד הנדרש תרבות בתאי גזע הם דומה לזו של מערכות תרבות אחרים תא הכולל ספסל העליונה צנטריפוגות, CO 2 באינקובטור, זרימה למינרית רקמות ברדס תרבות הפוכה מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במצלמה דיגיטלית. בתאי גזע בודד גם ניתן לשכפל ו יכול להיות מאוחסן לטווח ארוך חנקן נוזלי עבור 1,2 הלימודים הנוכחית או בעתיד. כל ריאגנטים החומרים המשמשים לצורך הליך זה חייב להיות סטרילי לטפל בסביבה נקייה מחיידקים.
שלב 1: הכנת
- מעיל רקמת קולגן תרבות צלחות צלוחיות: אני סוג קולגן שמקורם בעור עגל (0.1 גרם לליטר 1; סיגמא אולדריץ '). Plasticware המעיל כולל: T-25 צלוחיות, 6 או 12 צלחות טוב, מנות (60 ו - 100 מ"מ, BD פלקון) כפי שתואר קודם 1,2. נער בעדינות את plasticware כל חצי שעה, במשך 4 שעות כדי להבטיח אפילו ציפוי של הקולגן. הפתרון קולגן מוסר מכן. וגם plasticware מצופה מותר אז לייבוש למכסה המנוע רקמה תרבות עם אור UV ואת מכסה המנוע הן, כדי להבטיח סטריליות, ו סגרה בסופו של דבר או כיסו לשימוש מאוחר יותר.
- הכנת תרבית תאים בינוניים: 400mL DMEM (DMEM, גלוקוז גבוהה; Invitrogen), 50 מ"ל סרום מומת חום שור עוברית (FBS, Invitrogen), 50 מ"ל סרום סוס (HS, Invitrogen), ו - 5 מ"ל צ'יק העובר חלץ (CEE, מדויק כימית ושות ) יהיה ואקום מסונן באמצעות הפנויה 0.22 מיקרומטר-500-ml מערכת סינון סטרילי (קורנינג). פניצילין ועיקור / פתרון סטרפטומיצין (Invitrogen) יתווספו בסופו של דבר 100 יחידות / מ"ל. פתרונות מוכנים ניתן לאחסן 4 ° C למשך חודש אחד לפחות. פתרון זה משמש כדי לנתק את התאים מהבקבוק כאשר תרבויות פיצול או הכנת תאים להשתלה.
- חימום פתרונות בידוד תא: ריאגנטים הבא צריך להיות מחומם ל 37 מעלות לפני השימוש שלהם בבידוד בתא C: שנאגרו של האנק תמיסת מלח (HBSS, Invitrogen); 0.2% (wt / כרך) collagenase מסוג XI (Sigma אולדריץ '), עם ממוצע של 3,200 יחידות העיכול קולגן לכל מ"ל HBSS; Dispase 2.4 units/1mL (Invitrogen); 0.5% (wt / כרך) טריפסין (Invitrogen).
- לעקר ציוד כירורגי הכנה: הליך כירורגי מחייב מכשירי ניתוח סטרילי כולל: בגדלים שונים מלקחיים, מיקרו מספריים, מספריים איריס ו / או להבי אזמל. בנוסף, 15 ו - 50 מ"ל צנטריפוגות צינורות פוליפרופילן (BD פלקון); מסננת Cell (גודל הנקבוביות 70 מ ') (BD פלקון); 18 -, 23 - ו 27-מד מחטים (BD PrecisionGlide), ו 10 - או 20 מ"ל מזרקים סטריליים (BD).
שלב 2: ביופסיות רקמות, בידוד ניתוק מכני 1-4
ביופסיות רקמות מבוצעות מתחת למכסה המנוע תרבות סטרילית כוללים טריים שנקטפו הגידים ואת שרירי השלד מתקבלים השרירים השוקה או soleus של hindlimb של wild-type עכברים (C57BL/6J נקבה, 4-5 שבועות של גיל או צעירים יותר, ג'קסון מעבדה). כל רקמות החיבור גלוי, כלי הדם, ורקמת השומן יוסרו אז מן דגימות ביופסיה. רקמות של גיד ושריר הם זיהו אז בזהירות תחת מיקרוסקופ ביתור כירורגי כדי להסיר שאריות עור ועצמות והניח בצלחת המכילה קר (4 ° C) HBSS (בתוספת להוסיף 5% FBS). רקמות מבודדות אז הם ממוקמים בנפרד על מנות המכיל קולגן מצופה HBSS קר יהיה טחון (<1x1 מ"מ 3) לתוך slurry גס באמצעות מיקרו מספריים ו / או להבי אזמל.
שלב 3: עיכול אנזימתי של הרקמות:
הרקמה טחון אז הוא ניתק enzymatically באמצעות סדרה של צעדים 2,4,5
- מעבירים את slurries רקמות טחון לתוך 15 מ"ל צינורות נפרדים צנטריפוגות בסל"ד 3500 ~ ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- הסר את supernatant, לשטוף עם HBSS וחזור על צנטריפוגה שוב.
- הסר את supernatant, ולעכל אלה slurries ידי הוספת 10 מ"ל של prewarmed 0.2% collagenase מסוג XI (Sigma). דגירה של 60 דקות בשעה 37 ° C תוך ברציפות מנענעת בעדינות את הצינורות. לחלופין, ללחוץ את ידו בכל 10 דקות.
- צנטריפוגה ו resuspend אלה slurries ב 10 מ"ל dispase (2.4 יחידות / מ"ל, Gibco) פתרון. דגירה של 45 דקות בשעה 37 ° C, רעד בידיים או מתנדנד בעדינות כל 10 דקות.
- צנטריפוגה מחדש להשעות אלה slurries ב 10 מ"ל של תמיסת טריפסין 0.2% HBSS. דגירה תשתנה בהתאם למידה שבה תאים בודדים משתחררים הרקמות אשר יכול להתבצע על ידי התבוננות ההשעיה תחת מיקרוסקופ. זה לא מומלץ לעלות על 30 דקות בשעה 37 ° C עם היפוך הצינורות או מתנדנד בעדינות כל 10 דקות.
- צנטריפוגה התא וכתוצאה מכךs מחדש להשעות את התא גלולה ב 10 מ"ל של הפצת נשק בינוני (PM).
- לנתק את ההשעיה התא על ידי העברת לחלץ באמצעות סדרה של מחטים. התאים מועברים לאחר מכן 2 פעמים דרך 18G, אז 23G, ולבסוף מחט 27G.
- לעבור את תמצית התא דרך מסננת 70 מיקרומטר תא.
שלב 4: Preplating לבודד אוכלוסיות תאים שונים המבוססים על הידבקות התא שיעור 1-3
- צנטריפוגה ו resuspend את כדורי תא בינוני הפצתו.
- התא פלייט תערובות על בקבוק T-25 קולגן מצופה (או 60 צלחת מ"מ) ולסמן אותו PP1. ההשעיה התא צריך לשמור כבעל מספר גדול של גרעינים השבירה ופסולת אחרת מתחת למיקרוסקופ.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס humidified, 5% CO 2 באינקובטור למשך 2 שעות.
- העברת התאים nonadherent כדי קולגן חדש מצופה T-25 צפחת (או 60 צלחת מ"מ) סימן הוא כמו PP2. הוסף 5 מ"ל PM לתוך צלחת שכותרתו PP1. התאים הראשונים אשר דבקות לצרף בקבוק הם ברובם myofibroblasts 3.
- החזר את צלוחיות אל האינקובטור לעוד 24 שעות, כדי להעביר תאים nonadherent חדש קולגן מצופה T-25 צפחת (או צלחת) ולסמן אותו PP3. הוסף 5 מ"ל של מדיום הפצת נשק לתוך צלחת שכותרתו PP2. תאים אלה דבקות אשר לצרף בקבוק זה הם בעיקר fibroblasts 2,3.
- חזור צלוחיות אל האינקובטור לחזור על התהליך בעוד 24 שעות עד PP6 האוכלוסייה נוצר. שמרו על כל קבוצה של תאים מושעה ולאפשר להם להתרבות ולבחון אותם באופן קבוע באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. PP3-PP4 הם בעיקר myoblasts בעוד הלוויין לתאי שריר נראים לעתים קרובות בעיקר PP5 2.
- רוב התאים לאט דבקות בדרך כלל לצרף ידי PP6. בשלב זה, התאים להופיע קטן, עגול השבירה, אור הם דלילים מאוד מספר נחשבים תא גזע 1,2 האוכלוסייה.
שלב 5: זיהוי הרחבה בתאי גזע בודד
- מבודדים PP6 תאים מעטים ביותר ויש צורך להישמר בינוני FBS הפצת נשק עשיר (20% FBS ב DMEM) כי הוא השתנה מדי יום. רוב התאים הנמצאים למות PP6 התרבות במהלך 1-2 השבועות הבאים של culturing, אבל גדול, אוכלוסייה בריאה PP6 נוצרת בדרך כלל לאחר 1-2 שבועות נוספים של התרחבות. בתאי גזע שבודדו עכברים מאוד לבטא בתאי גזע אנטיגן 1 (Sca1), CD34, kinase כבד עוברית 1 (Flk1), ו סמנים גזע אחרים 1,2,6,7 אשר ניתן דמיינו באמצעות מכתים immunocytochemical. אלה בתאי גזע גם להפגין יכולות התמיינות מספר 3,6,8.
- תאים בודדים נשמרים והרחיב בצפיפות נמוכה תא בתרבות (12 מנות גם ב 50-100 תאים / או גם <מפגש 20-30% בבקבוק או צלחת) כדי למנוע 1,2 בידול. תאים מעטים טופס שיבוטים במהלך הרחבה, אלה בתאי גזע משובטים יכול לעבור זמן רב התפוצה (LTP) עבור כל יכולת מחקרים אחרים. בתאי גזע משובטים גם ניתן לאחסן באמצעות חנקן נוזלי כללי אחסון הליכים כגון תא בינוני PM DMSO עם 10%. בצע מספר נמוך של מניות מעבר בתאי גזע עבור כל המחקרים את השני בחזרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זה כבר הכיר בכך כמה רקמות בוגרות מכילים בתאי גזע מרובים. במהלך השנים האחרונות של המחקר, בתאי גזע זוהו ברקמות השלד רך, כולל שריר גיד השלד. זה פרוטוקול הנוכחית פרטים הליך המכונה הטכניקה preplate שונה, כי שימש בהצלחה במעבדה שלנו לבודד בתאי גזע בוגרים של גידים שרירי השלד. באמצעות טכניקה שונה preplate שתוארו לעיל התאים ניתן לחלק את האוכלוסיות כמה בהתבסס על מאפייני הדבקה שלהם צלוחיות מצופה קולגן (איור 1). Fibroblasts ו myofibroblasts נמצא בתוך הרקמות מהר לדבוק צלוחיות מצופה קולגן בתוך 24-48 שעות מופרדים תחילה PP1-PP2 של תאים אחרים. בתאי האנדותל myogenic או לדבוק צלוחיות קולגן מצופה לאחר פרק זמן ארוך יותר, בתוך 48-96 שעות (PP3-PP5), וכן ניתן לקצור וזוהו על ידי שטח פני התא שלהם סמנים. התאים preplated כעבור 96 שעות ומעלה (PP6), נחשבים בתאי גזע בוגרים (איור 2). התאים preplate להופיע מאוחר קטן, עגול, שקוף בתחילת הבידוד שלהם יכול להיות מאופיין יותר על ידי cytometry זרימה או immunocytochemistry לביטוי שלהם אנטיגן בתאי גזע 1 (Sca1), CD34, kinase כבד עוברית 1 (Flk1), ו אחרים בתאי גזע סמנים (איור 3). בתאי גזע בודד יש יכולת התחדשות עצמית מחקרים ניסויים הראו multipotency שלהם באמצעות בידול שלהם לתוך שלוש שכבות נבט: והמזודרם, האאקטודרם, ואת האנדודרם 9. חקירות מרובות חשפו גם כי אלה בתאי גזע להתמיין לתאי השושלת והמזודרם כולל osteocytes, adipocytes, chondrocytes, ותאי hematopoietic 6,8. מחקרים אחרים הראו כי תאי גזע בוגרים להתמיין שושלות תאים האאקטודרם דרך הביטוי שלהם סמנים תא עצב גליה ואת יכולתם לשפר את תפקוד הגפיים אחרי העצבים ההיקפית נפגע 10. גזע אלו תאים מבודדים מבוגר כבר מועיל לתיקון רקמות שריר ושלד פצועים וחולים, ועל אחרים הקשורים במחקרים vivo בוצעו על רקמות אחרות, כולל הלב, הכבד, וחוט השדרה, כמו גם מצבים רפואיים מסוימים, כמו submucosa המעי הדק ושלפוחית השתן לטיפול מתח בריחת שתן 9.
באיור 1.
איור 2.
איור 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
החוקרים מעריכים מאוד של גב 'Haiying פאן מר איאן Bellayr לעזרה הטכנית שלהם על בידוד התא הסרטים הנוכחי מר קייל הולדן ומר יונתן לוקאס על עזרתם על עריכת שקופיות. תודה רבה על הרשימה הבאה של אנשים שהיו מעורבים בפיתוח של טכניקות preplate השתנה בשנים האחרונות: בני הזוג. בורהאן Gharaibeh, BaoHong קאו, דיזי ברידג'ט, תומס ר 'פיין, Aiping לו, Hairong פנג, הידקי אושימה, בו זנג, Xiaodong מו, Kimimasa Tobita, רון ינקובסקי, Makato Ikezawa. אנו אסירי תודה על הסיוע הטכני של ג'יימס ה 'Cummins, ריאן Pruchnic, יוסף Feduska, רבקה ג Schugar, Haiying פאן וג'סיקה Tebbets. המחבר גם רוצה להכיר תמיכה כספית עבור עבודה זו מפני ניוון האגודה שרירים (מד"א), המכון הלאומי לבריאות (NIH), משרד ההגנה (DOD), בית החולים לילדים של פיטסבורג של UPMC, המחלקה ניתוח אורתופדי, של אוניברסיטת פיטסבורג.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | #11995-073 | |
| FBS | Invitrogen | #10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | #26050-088 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | #CE650T-10 | |
| 100U ml penicillin/streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | #14190-250 | |
| Hank's Buffered Salt Solution | Invitrogen | #24020-117 | |
| Collagenase type XI 0.2%(wt/vol) | Sigma-Aldrich | #C7657 | |
| Dispase2.4U ml | Invitrogen | #17105-041 | |
| Trypsin-EDTA0.5%(wt/vol) (10x;5g liter trypsin (1:250) | Invitrogen | #15400-054 | |
| Collagen for coating flask : Type I collagen derived from calf skin 0.1 g liter | Sigma-Aldrich | #C-9791 | |
| DMSO | Sigma | #D-2650 |
References
- Gharaibeh, B. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).
- Qu-Petersen, Z. Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: potential for muscle regeneration. J Cell Biol. 157, 851-864 (2002).
- Li, Y. &, Huard, J. Differentiation of muscle-derived cells into myofibroblasts in injured skeletal muscle. Am J Pathol. 161, 895-907 (2002).
- Watt, D. J., Lambert, K., Morgan, J. E., Partridge, T. A. &, Sloper, J. C. Incorporation of donor muscle precursor cells into an area of muscle regeneration in the host mouse. J Neurol Sci. 57, 319-331 (1982).
- Lu, A. Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics. Gene Ther. 15, 1116-1125 (2008).
- Lee, J. Y. Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing. J Cell Biol. 150, 1085-1100 (2000).
- Cao, B. The role of receptors in the maturation-dependent adenoviral transduction of myofibers. Gene Ther. 8, 627-637 (2001).
- Cao, B. Muscle stem cells differentiate into haematopoietic lineages but retain myogenic potential. Nat Cell Biol. 5, 640-646 (2003).
- Huard, J. Regenerative medicine based on muscle stem cells. J Musculoskelet Neuronal Interact. 8, (2008).
- Gates, C. B., Karthikeyan, T., Fu, F. &, Huard, J. Regenerative medicine for the musculoskeletal system based on muscle-derived stem cells. J Am Acad Orthop Surg. 16, 68-76 (2008).
