Summary
隔离肌肉骨骼软组织的成人干细胞的基础上坚持细胞的速度向烧瓶。
Abstract
成人干细胞及其在再生医学中的应用方面一直讨论。成人干细胞产生了极大的兴奋治疗受伤和患病的组织，由于其令人印象深刻的功能，经过多系细胞分化和自我更新的能力。最重要的是，这些特质使他们在使用自体细胞移植治疗的优势。目前的协议将介绍读者修改preplate技术，软组织，如肌腱和肌肉，骨骼肌肉系统1
Protocol
在一般情况下，修改后的完整preplate过程需要1-2天的准备，1周执行的技术过程，细胞与免疫细胞化学鉴定2-3天，和一个额外的2-3周干细胞的人口膨胀。干细胞培养所需的设备与其他细胞培养系统，其中包括台式离心机， 二氧化碳培养箱，层流组织培养罩和倒置显微镜配备荧光和一台数码相机。分离出干细胞也可以被克隆，并可以储存在液氮目前或未来的研究1,2长远。此过程中使用的所有试剂和材料必须是无菌的无菌处理。
步骤1：准备
- 胶原蛋白外衣组织培养皿和培养瓶：I型胶原小腿皮肤（1公升0.1克; Sigma - Aldrich公司）所得。外套塑料制品包括：T - 25瓶，6或12孔板，菜（60和100毫米，屋宇署猎鹰）前1,2所述。轻轻摇动塑料制品每隔半小时，4小时，以确保涂层的胶原蛋白。胶原蛋白溶液，然后删除。涂塑料制品，然后让其干燥，在组织培养罩无论在紫外灯和引擎盖，以保证无菌，终于扼或覆盖以备后用。
- 准备细胞培养液：400毫升DMEM培养基（DMEM培养液，高血糖; Invitrogen公司），毫升热灭活胎牛血清（FBS，Invitrogen公司），50毫升马血清（HS，Invitrogen公司），和5 mL鸡胚提取物（CEE，准确化工有限公司）将使用一次性的0.22微米500毫升无菌过滤系统（康宁）的真空过滤。无菌青霉素/链霉素溶液（Invitrogen公司）将被添加最后100单位/ mL。制备的溶液可以保存在4 ° C，至少一个月。使用这个解决方案是从烧瓶中分离的细胞分裂的文化时，或准备用于移植的细胞。
- 暖起来细胞分离的解决方案：下列试剂到被温暖最多至37 °彗星之前他们利用细胞的分离：汉克的缓冲盐溶液的HBSS，Invitrogen公司; 0.2％（重量/卷）胶原酶的类型第十一（西格玛Aldrich公司），与3200胶原蛋白消化每毫升的HBSS单位的平均水平; Dispase 2.4 units/1mL（Invitrogen公司）;胰蛋白酶（Invitrogen）的0.5％（WT /卷）。
- 消毒，准备手术设备：手术过程需要包括无菌手术器械：不同大小的钳，微型剪刀，虹膜剪刀和/或手术刀片。此外，15日和50 mL聚丙烯离心管（BD猎鹰）;细胞过滤器（孔径70米）（BD猎鹰），18 - ，23 - 和27号针（BD PrecisionGlide）和10 - 20毫升（BD）的无菌注射器。
第2步：组织切片，隔离和机械分离1-4
组织切片进行下一个无菌培养罩，包括新鲜收获的肌腱和骨骼肌肉获得的野生型小鼠的后肢（女C57BL/6J，年龄4-5周或更年轻，杰克逊的胫骨或比目鱼肌实验室）。任何可见的结缔组织，血管，脂肪组织，然后从活检样品中删除。肌腱和肌肉组织，然后仔细辨认解剖显微镜下手术，以消除皮肤和骨骼的残余，并放置在一个包含冷（4 ° C）的HBSS（添加5％FBS的补充）。盘胶原涂层的菜肴，包含冷的HBSS，然后分别置于孤立的组织将被剁碎成粗浆使用微型剪刀和/或手术刀片（<1 × 1毫米3 ）。
第3步：酶消化组织：
剁碎的组织，然后通过一系列步骤2,4,5酶分离
- 转移到单独的15毫升管和离心机在4 ° C 5分钟〜3500转的肉末组织泥浆。
- 去除上清，用HBSS中，再次重复离心。
- 移除上清液，加入10毫升预热0.2％胶原酶型第十一章（Sigma公司）和消化这些泥浆。孵育60分钟，在37 ° C的同时，不断轻轻摇晃管。另外，由专人每10分钟摇动。
- 离心和重新悬浮于10 ml dispase（2.4单位/ ml，Gibco公司）解决方案，这些泥浆。在37 ° C孵育45分钟，双手颤抖，或轻摇每10分钟。
- 离心机和重新挂起，这些泥浆在0.2％胰蛋白酶的HBSS溶液10毫升。孵化的基础上，以单细胞组织可以通过显微镜下观察暂停执行释放的程度会有所不同。这是不建议超过30分钟，在37 °反相管C或轻摇每10分钟。
- 离心产生的细胞S和重新暂停在增殖培养基（下午）10毫升的细胞沉淀。
- 通过一系列针提取分离的细胞悬液。细胞，然后通过一个18G的2倍，那么23G，和最后一个27G的针头。
- 穿过70微米的细胞过滤器，细胞提取物。
第4步：Preplating来隔离不同的细胞对细胞粘附率1-3人口
- 离心机和增殖培养基重悬细胞沉淀。
- 板的细胞到胶原蛋白涂层的T - 25瓶（或60毫米盘）的混合物，如PP1的标志。应拥有大量的屈光细胞核和其他碎片，在显微镜下观察细胞悬液。
- 在37 °，饱和湿度，5％的CO 2培养箱中培养2小时中的C。
- nonadherent细胞转移到新的胶原蛋白涂层的T - 25瓶（或60毫米盘）和标记为PP2。添加到标有PP1的板块下午5毫升。早期坚持细胞附着于烧瓶中大多是肌纤维母细胞3。
- 返回烧瓶孵化器，另外24小时，nonadherent细胞转移到一个新的胶原蛋白涂层的T - 25瓶（或菜），它标记为PP3。添加到PP2板的5毫升增殖培养基。这些坚持细胞附着到这个烧瓶大多是成纤维细胞2,3。
- 返回烧瓶孵化器和在另一个24小时内重复的创建过程，直到人口PP6。保持各组悬浮细胞的增殖，并定期检查他们使用倒置显微镜，并允许他们。 PP3 - PP4的大多是成肌细胞肌卫星细胞常常被看作主要PP5 2。
- 慢慢坚持细胞通常由PP6重视。在这一阶段，细胞出现小而圆，光的折射率，在数量上很稀疏，被认为是干细胞的人口1,2。
第5步：识别和分离出干细胞扩张
- 隔离PP6细胞是极少数，需要保持胎牛血清丰富的增殖培养基（20％在DMEM培养液胎牛血清）每天更换。大部分细胞在下面的1-2周的培养，但目前在PP6文化死通常是一个大型的，健康的PP6人口扩张的一个额外的1-2周后创建的。从小鼠的干细胞高效表达干细胞抗原1（SCA1），CD34，胎肝激酶1（的Flk1），及其他干标记1,2,6,7可通过免疫细胞化学染色观察。这些干细胞还表现出多种分化能力 3,6,8 。
- 分离出的细胞是维持和扩大在文化的细胞密度低（12菜50-100个细胞/孔或<20-30％汇合在烧瓶或菜），以避免分化 1,2 。极少数细胞形成过程中扩张的克隆，这些克隆的干细胞可以进行长时间扩散（LTP），任何其他能力的研究。克隆的干细胞也可以储存在液态氮使用一般的细胞存储程序，例如用10％DMSO下午中等。设为任何其他备份研究干细胞的低通过股票的数量。
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Discussion
人们已经认识到，一些成人组织包含多个的干细胞。在过去几年的研究，干细胞已被发现在肌肉骨骼软组织，包括骨骼肌肉和肌腱。目前协议的细节一个过程，作为修改preplate技术，已成功在我们的实验室，从肌腱和骨骼肌肉中分离出成人干细胞。使用上面描述的细胞修改preplate技术可分为基于其粘附胶原涂层烧瓶（图1）的特点，几个人口。发现组织内的成纤维细胞和肌纤维母细胞快速坚持在24-48小时内的胶原蛋白涂层烧瓶，最初是从其他细胞分离，PP1 - PP2。坚持生肌或内皮细胞后一个较长的一段时间，在48-96小时内，（PP3 - PP5）的胶原蛋白涂层烧瓶，并能有所收获，其细胞表面标志确定。后来的预镀细胞，96小时或更高版本（PP6），被视为成人干细胞（图2）。后期的preplate细胞出现小的，圆形，并开始隔离半透明，并且可以进一步为他们的干细胞抗原1（SCA1），CD34 +，胎肝激酶1（的Flk1）的表达，流式细胞仪或免疫细胞化学的特点，并其他干细胞标记物（图3）。分离出干细胞，通过其分化成三个胚层自我更新的能力和实验研究已证明其多能：中胚层，外胚层，内胚层 9 。多个调查也显示，这些干细胞分化成的中胚层谱系细胞，包括骨细胞，脂肪细胞，软骨细胞和造血干细胞6,8。其他研究已经表明，成体干细胞分化成外胚层细胞谱系，通过他们的神经元和神经胶质细胞标记和他们的能力，提高肢体功能后的末梢神经已经损坏10的表达。这些孤立的成人干细胞修复受伤和患病的肌肉骨骼组织是有益的， 和其他体内研究有关的其他组织包括心脏，肝脏，脊髓以及特定的医疗条件，如小肠黏膜下层和治疗膀胱压力性尿失禁9。
图1。
图2。
图3。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者们大大赞赏细胞分离技术帮助，为当前的电影和卡尔霍顿先生和乔纳森卢卡斯先生为他们的幻灯片编辑上的帮助海鹰潘女士和先生，Ian Bellayr。 DRS：涉案人员已与过去几年的发展，修改preplate技术下面的列表非常感谢。 BURHAN Gharaibeh宝红曹迪希布里奇特，托马斯R ·佩恩，张爱萍陆，海荣鹏大岛，东条英博，曾晓东，木，Kimimasa飞田，罗恩Jankowski，Makato Ikezawa。我们是从詹姆斯H康明斯，瑞安Pruchnic，约瑟夫Feduska，丽贝卡C. Schugar，海鹰潘和杰西卡Tebbets技术援助表示感谢。笔者也将像到承认的肌肉萎缩症协会（MDA）的，：美国国立卫生研究院研究院（NIH），国防部（DOD），儿童匹兹堡医院UPMC的，部对这项工作的资助矫形外科杂志，和美国匹兹堡大学。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | #11995-073 | |
| FBS | Invitrogen | #10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | #26050-088 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | #CE650T-10 | |
| 100U ml penicillin/streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | #14190-250 | |
| Hank's Buffered Salt Solution | Invitrogen | #24020-117 | |
| Collagenase type XI 0.2%(wt/vol) | Sigma-Aldrich | #C7657 | |
| Dispase2.4U ml | Invitrogen | #17105-041 | |
| Trypsin-EDTA0.5%(wt/vol) (10x;5g liter trypsin (1:250) | Invitrogen | #15400-054 | |
| Collagen for coating flask : Type I collagen derived from calf skin 0.1 g liter | Sigma-Aldrich | #C-9791 | |
| DMSO | Sigma | #D-2650 |
References
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