Summary
フラスコに細胞の付着の速度に基づいて、筋骨格系の軟部組織から成体幹細胞を単離する。
Abstract
成体幹細胞は、長い再生医療への応用に関して議論されている。成体幹細胞は、多系統の細胞の分化と自己複製能を受けることにより、その印象的な機能に負傷し、病変組織を治療するための興奮を大いに生成している。最も重要なことは、これらの資質は、自家細胞移植療法での使用に有利にしている。現在のプロトコルは、1である筋骨格系の軟部組織、例えば、腱や筋肉、修正されたpreplateのテクニックを読者に紹介する
Protocol
一般的には、完全な修正preplateの手順は、準備の1〜2日、技術的な手順を実行するの1週間、免疫細胞と細胞の同定の2〜3日、および幹細胞集団の拡大のさらに2〜3週間を必要とします。幹細胞培養に必要な機器は、ベンチトップ遠心機、CO 2インキュベーター、層流の組織培養フードと蛍光とデジタルカメラを搭載した倒立顕微鏡を含む他の細胞培養システムのそれに似ています。分離された幹細胞は、クローニングすることができると、現在または将来の研究の1,2のための液体窒素中で長期的に保存することができます。この手順で使用されるすべての試薬および材料は滅菌と無菌的に処理する必要があります。
ステップ1：準備
- コラーゲンコートの組織培養ディッシュやフラスコ：子牛の皮（1リットルで0.1グラム、Sigma - Aldrich社）から派生したI型コラーゲン。コートへのプラスチック容器は、次のとおりとして1,2の前に説明したT - 25フラスコ、6または12ウェルプレート、皿を（60、100ミリメートル、BDファルコン）。ゆっくりと4時間のコラーゲンにもコーティングを確保するために、プラスチック容器を30分おきに振る。コラーゲン溶液は、その後削除されます。とコーティングされたプラスチック製品は、無菌性を確保するために、UV光とフードとの両方の組織培養フード内で乾燥させる、そして最終的にrecappedまたは後で使用するためにカバー。
- 、、50mLの熱不活性化ウシ胎児血清（FBS、インビトロジェン社）、50mLのウマ血清（HS、Invitrogen社）、及び5mLのニワトリ胚抽出物（CEE、正確な化学株式会社400ML DMEM（Invitrogen社DMEM、高グルコース）：細胞培養の培地を準備）使い捨て0.22μmの500mlの滅菌フィルターシステム（コーニング）を使用してフィルタ処理された真空になります。無菌ペニシリン/ストレプトマイシン溶液（Invitrogen）を最終的に100単位/ mLを追加されます。調製された溶液は、少なくとも一ヶ月に4℃で保存することができます。このソリューションは、ときに文化を分割または移植用細胞を調製フラスコから細胞を剥離するために使用されます。
- 細胞分離のためのソリューションをウォームアップ：下記の試薬を37にウォームアップする必要があります° C細胞分離のためのその使用前に：ハンクのバッファ塩溶液（HBSS、Invitrogen社）、0.2％（wt / vol）のコラゲナーゼタイプXI（シグマmLのHBSS 3,200コラーゲン消化単位の平均で- Aldrich社）、;ディスパーゼ2.4 units/1mL（Invitrogen社製）、0.5％（wt / vol）のトリプシン（インビトロジェン）。
- 準備のために外科手術機器の滅菌：異なるサイズの鉗子、マイクロはさみ、アイリスはさみおよび/または外科用メス刃：手術の手順は、含む滅菌手術器具が必要です。また、15および50 mLのポリプロピレン遠心チューブ（BDファルコン）、セルストレーナー（孔径70メートル）（BDファルコン）、18 - 、23 - および27ゲージの針（BD PrecisionGlide）、及び10 - または20 - mlの滅菌シリンジ（BD）。
ステップ2：組織生検、単離および機械的解離1月4日
組織生検は無菌培養のボンネットの下に行われ、新鮮な収穫腱や骨格筋を含む、野生型マウスの後肢（女性C57BL/6J、4-5週齢または若い、ジャクソンの脛骨またはヒラメ筋から得られる研究所）。目に見える結合組織、血管、脂肪組織は、生検サンプルから削除されます。腱と筋肉の組織は、慎重に皮膚と骨の残骸を除去する外科解剖顕微鏡下で同定し、含有する冷（4℃）HBSS（FBSの5％を追加で補充）。を皿に置かれている分離された組織は、その後別々に冷HBSSを含むコラーゲンコートディッシュ上に配置されており、マイクロシザー構造および/ またはメス刃を用いて粗いスラリーに（<1x1のmm 3の ）ミンチされます。
ステップ3：組織の酵素消化：
みじん切りの組織は、手順2,4,5の一連の後、酵素的に解離している
- 別の15 mlチューブと4時〜3500rpmで遠心° Cで5分にミンチ組織のスラリーを転送する。
- 上清を除去、HBSSで洗浄し、再度遠心操作を繰り返します。
- 上清を除き、あらかじめ温めておいた0.2パーセントコラゲナーゼタイプXI（シグマ）10 mlを加えることによってこれらのスラリーを消化。継続的に穏やかにチューブを揺らしながら、37℃で60分間インキュベートする。また、手で10分ごとに振る。
- 10ミリリットルディスパーゼ（2.4単位/ mL、Gibco社）溶液中でこれらのスラリーを遠心し、懸濁します。手で振ったり、軽く10分ごとに揺らし、37℃で45分間インキュベートする。
- 遠心分離し、これらのスラリーは、0.2％トリプシンHBSS溶液10mlに再懸濁する。インキュベーションは、単一の細胞を顕微鏡下でサスペンションを観察することによって実行できる組織から放出される範囲に基づいて変化します。それは、反転管で37℃で30分を超えないようにCを推奨したり、静かに10分ごとに揺動されていません。
- 得られた細胞を遠心sと再サスペンド増殖培地（PM）の10mlに細胞ペレットを。
- 針の一連の抽出液を渡すことによって、細胞懸濁液を取り除きます。細胞は、その後、18Gを通して23Gを2回通過し、最終的に27G針されています。
- 70μmのセルストレーナーを介して細胞抽出液を渡します。
ステップ4：細胞接着率1-3に基づいて異なる細胞集団を分離するPreplating
- 遠心分離し増殖培地で細胞ペレットを再懸濁します。
- コラーゲンコートT - 25フラスコ（または60 mmディッシュ）上にプレート細胞の混合物とPP1としてマークします。細胞懸濁液を顕微鏡で屈折原子核と他の破片の多数を所有していると観察する必要があります。
- 37℃で2時間加湿、5％CO 2インキュベーターでC。
- T - 25フラスコ（または60 mmディッシュ）とマークがPP2となる新しいコラーゲン被覆に非接着細胞を移す。 PP1というラベルの付いたプレートにPMを5mlを追加。フラスコに付着初期の付着した細胞は、主に筋線維芽細胞3です。
- 別の24時間インキュベーターにフラスコを返す、新しいコラーゲンをコートしたT - 25フラスコ（または皿）とPP3としてそれをマークするために非接着細胞を移す。 PP2ラベルの付いたプレートに増殖培地5mlを追加。このフラスコに付着これらの接着した細胞は、主に線維芽細胞2,3です。
- インキュベーターにフラスコを返し、人口PP6が作成されるまで、別の24時間以内に手順を繰り返します。浮遊細胞の各グループを維持し、それらが増殖し、倒立顕微鏡を使用して定期的にそれらを検査することができます。 PP3 - PP4筋衛星細胞がしばしばPP5 2で主に見ている間にほとんどが筋芽細胞です。
- 徐々に接着した細胞のほとんどは、通常、PP6で取り付けます。この段階で、細胞は小さく、円形、光屈折率を表示され、数は非常に疎であり、幹細胞集団の1,2と見なされます。
ステップ5：隔離された幹細胞の同定と拡大
- 孤立PP6細胞の数が非常に少ないですし、毎日変更されるFBS豊富な増殖培地（DMEM 20％FBS）で維持する必要があります。細胞のほとんどは、培養の次の1-2週間の間にPP6文化のダイに存在しているが、大規模な、健康なPP6人口は、通常、拡張の追加の1-2週間後に作成されます。マウスから単離した幹細胞を高発現幹細胞抗原1（SCA1）、CD34、胎児肝キナーゼ1（Flk1）、および免疫細胞化学染色を介して可視化できる他の幹マーカー1,2,6,7。これらの幹細胞はまた、複数の分化能力3,6,8を示 す。
- 単離された細胞は、分化の1,2を避けるために、培養中の低細胞密度（50〜100細胞/ウェルまたはフラスコやディッシュの<20-30％コンフルエントで12ウェルディッシュ）に維持して展開されます。非常に少数の細胞が膨張中にクローンを形成し、これらのクローンES細胞は、他の能力の研究のための長い時間の増殖（LTP）を受けることができる。クローンES細胞はまた、10％DMSOとPMの培地を、例えば一般的な細胞の保管手順を使用して液体窒素中で保管することができます。他のバックアップ研究のための幹細胞の低継代株の数を作る。
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Discussion
それはいくつかの成人組織では、複数の幹細胞が含まれていることが認識されている。研究の過去数年間、幹細胞は骨格筋と腱を含む柔らかい筋骨格系組織で検出されている。成功した腱や骨格筋から成体幹細胞を分離するために我々の研究室で使用されている修正preplateのテクニックとして知られているこの現在のプロトコルは、詳細手順を、。細胞上記の変更preplateのテクニックを使用することをコラーゲンコートしたフラスコ（図1）への接着特性に基づいていくつかの集団に分けることができます。組織内に存在する線維芽細胞および筋線維芽細胞はすぐに24時間から48時間以内にコラーゲンコートしたフラスコに付着し、最初はPP1 - PP2で他の細胞から分離されています。筋原性または内皮細胞は、48〜96時間内でより長い期間、（PP3 - PP5）の後にコラーゲンコートしたフラスコに付着し、収穫し、それらの細胞表面マーカーによって識別することができます。後でpreplated細胞、96時間以降（PP6）は、成体幹細胞（図2）とみなされます。後半preplate細胞は、小さな丸い、およびそれらの分離の初めに半透明表示され、さらに幹細胞の抗原1（SCA1）、CD34、胎児肝臓キナーゼ1（Flk1）の発現のためのフローサイトメトリーまたは免疫細胞化学によって特徴付けることができる、と他の幹細胞マーカー（図3）。中胚葉、外胚葉、および内胚葉9：三胚葉への分化を通じて多能を実証している孤立した幹細胞は自己複製および実験的研究のための能力を持っている。複数の調査は、これらの幹細胞は骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、および造血細胞6,8を含む中胚葉系列の細胞に分化することが明らかになっている。他の研究では、成体幹細胞は神経細胞およびグリア細胞のマーカーと末梢神経が10を損傷しているafter手足の機能を向上させる能力の彼らの発現を介して外胚葉の細胞系譜に分化することを明らかにした。これらの分離された成体幹細胞が負傷したと病気の筋骨格系の組織を修復するための有益され、in vivo試験に関連する他の治療に心臓、肝臓、脊髄だけでなく、小腸粘膜下組織や膀胱のような特定の医学的条件を含む他の組織で行われているいる腹圧性尿失禁9。
図1。
図2。
図3。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
著者は、現在のフィルムとスライドの編集上の彼らの助けのための氏カイルホールデン氏とジョナサンルーカスのための細胞分離に与える技術的なヘルプのために氏鷹パンとイアンBellayrの大きく感謝しています。博士：過去数年にわたって修正されたpreplate技術の開発に関わってきた人の、以下の一覧に感謝。 Burhan Gharaibeh、宝洪曹、Deasyブリジット、トーマスR.ペイン、愛平陸、海融鵬、秀樹大島、ボー曽、暁東ムー、Kimimasa飛田、ロンJankowski、Makato池澤。我々は、James H.カミンズ、ライアンPruchnic、ジョセフFeduska、レベッカC. Schugar、海鷹パンとジェシカTebbetsからの技術支援に感謝しています。著者はまた、筋ジストロフィー協会（MDA）、国立衛生研究所（NIH）、国防総省（DOD）、UPMCのピッツバーグの小児病院、科からこの仕事のための財政支援に感謝整形外科、およびピッツバーグ大学。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | #11995-073 | |
| FBS | Invitrogen | #10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | #26050-088 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | #CE650T-10 | |
| 100U ml penicillin/streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | #14190-250 | |
| Hank's Buffered Salt Solution | Invitrogen | #24020-117 | |
| Collagenase type XI 0.2%(wt/vol) | Sigma-Aldrich | #C7657 | |
| Dispase2.4U ml | Invitrogen | #17105-041 | |
| Trypsin-EDTA0.5%(wt/vol) (10x;5g liter trypsin (1:250) | Invitrogen | #15400-054 | |
| Collagen for coating flask : Type I collagen derived from calf skin 0.1 g liter | Sigma-Aldrich | #C-9791 | |
| DMSO | Sigma | #D-2650 |
References
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