Overview
이 비디오는 CRISPR-Cas9를 사용하여 게놈이 변형된 트랜스제닉 드로소필라 파리를 식별하는 스크리닝 방법을 설명합니다. CRISPR-Cas9는 과학자들이 유기체의 게놈을 조작할 수 있는 방식에 혁명을 일으켰던 강력한 게놈 편집 도구입니다. 실시예 프로토콜에서, 우리는 환원 서열의 삽입이 분기리스(bnl) 유전자의 첫 번째 엑소온을 대체하는 CRISPR 생성 돌연변이를 식별하는 방법을 볼 수 있으며, 따라서 bnl 유전자 특이적 드라이버 라인, bnl-LexA를 생성한다.
Protocol
이 프로토콜은 Du et al.에서발췌, 게놈 편집에 의해 Drosophila에서 조직 특정 이진 전사 시스템을 생성하기위한 효율적인 전략, J. Vis. Exp. (2018).
1. 비행 유전학 및 스크리닝 (그림 1 및 그림 2)
- 주입된 태아가 성인으로 발전할 때, 각 G0 파리를 교차하여 균형을 이면 파리를 날아갑니다. 대상 적색을 포함하는 염색체에 적합한 밸러싱을 선택합니다.
- CO2 패드에서 각 G0 십자가에서 F1 자손을 마취하고 스테레오 현미경으로 10-20 남성을 무작위로 선택합니다. 도 2에표시된 대로 밸러저 여성에게 개별적으로 교차합니다.
- F2 유충부 부화 시 각 십자가에서 단일 F1 아버지를 선택하고 단일 플라이 게놈 DNA 준비 프로토콜을 사용하여 gDNA를 추출합니다.
- gDNA 추출 버퍼 준비: 10 mM Tris-Cl pH 8.2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, 실온에서 저장. 20 mg / mL Proteinase K 주식 용액을 준비하고 냉동실에 보관하십시오.
- 각 비행은 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 튜브에 라벨을 붙입니다. -80°C 냉동고를 하룻밤 동안 보관하십시오.
- Proteinase K의 200 μg/mL 최종 농도를 포함하는 gDNA 추출 버퍼의 신선한 작업 량을 준비합니다.
참고: 이 단계에는 이전 버퍼를 사용하지 마십시오. - 액체를 분배하지 않고 50 μL의 스퀴싱 버퍼가 들어있는 파이펫 팁으로 각 비행을 10-15 s로 스퀴시합니다. 나머지 버퍼를 튜브에 분배하고 잘 섞습니다. 20-30 분 동안 37 °C에서 배양하십시오.
- 95°C 의 열 블록에 튜브를 1-2분 동안 넣어 단백질Ae K를 비활성화시하십시오.
- 10,000 x g에서5 분 동안 아래로 회전하십시오. 추가 PCR 분석을 위해 4 °C에 준비하십시오.
- 동일한 방법을 사용하여 음수 제어 역할을 하는 노스-Cas9 플라이에서 gDNA를 준비합니다. 3단계 PCR 기반 화면을 수행하여 각 F1 남성의 gDNA를 템플릿5로사용하여 올바른 "종료"HDR(그림 1, 도 3)을식별합니다. 다음 PCR 반응 시스템에서 DNA 준비의 1 μL을 사용하십시오: 염료와 2x PCR 마스터 믹스의 10 μL, 각 프라이머의 1 μL (10 μM), DNA 템플릿 1μL 및 ddH2O의 7 μL.
- 도3A에도시된 바와 같이, 삽입 또는 교체의 존재를 위해 스크리머 fwd1 및 rev1을 사용하여 PCR을 수행; fwd2 및 rev2 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 3' 영역에서 삽입 또는 교체를 확인합니다. 프라이머 M13F 및 rev3를 사용하여 PCR을 수행하여 "엔드인"HDR(표 1C)을확인합니다.
- 확인된 종료 HDR로 플라이 라인을 유지하고 F2 세대의 균형 잡힌 주식을 설정합니다. 밸러던스로 건너가 다른 염색체에 의도하지 않은 돌연변이를 제거하기 위해 다시 날아갑니다.
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Representative Results
그림 1: CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집을 위한 워크플로우 개요를 통해 이진 전사 시스템을 생성합니다. 각 단계에 필요한 대략적인 시간 시간이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 게놈 편집 플라이 라인을 확립하기 위한 CRISPR 스크리닝 및 유전 적 교차 계획의 그림입니다. 유전 적 십자가에서 R은 3rd 염색체에 있는 편집된 진유전자를 의미합니다. MKRS (Tp(3;3)MRS, M(3)76A[1] 카[1] ry[2] Sb[1]),3rd 염색체 마커; TM6B(In(3LR)TM6B, 앤트[후] e[1] Tb[1])는3rd 염색체 밸러더입니다. 게놈 편집 플라이 스톡은 PCR 제품을 결정하는 F2 또는 F3 세대 파리 및 서열으로부터 추출된 게놈 DNA로부터 대상 영역을 증폭시키는 PCR에 의해 검증된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: CRISPR/Cas9 매개 엑슨 교체에 의해 bnl-LexA의 생성. (A) CRISPR/Cas9의 전략을 묘사한 회로도 드로잉은 BNL 궤적에서 엑슨 교체를 위한 HDR을 중재합니다. 상자 - 엑슨; 라인- 인트론; 대체기증자(pDonor-bnl:LexA)와HDR의 두 가지 가능한 결과가 나타났다. pDonor-bnl:LexA는 다음과 같은 기능을 가지고 있었다: (1) T2A-nls-LexA:p65 (~1.8kb) 시퀀스는 2 kb와 1.8 kb 긴 상동성 암 (대시 라인), (2) T2A 자가 절단 펩티드는 잔류 N 단자 bnl 엑시온과 nls-LexA:p65사이의 펩티드, (3) nls-LexA:p65 시퀀스 후 번역 정지 코돈(red*) 사이이다. 상기 HDR 제품은 bnl의모든 전사 및 전사 후 제어를 유지하며, LexA:p65 단백질은 내인성 Bnl과 동일한 패턴으로 생산될 것으로 예상됩니다. (B) 아가로즈 젤 사진은 3단계 PCR 스크리닝의 결과를 보여준다. 4개의 성공적인 엔드아웃 HDR 라인의 게놈 DNA로부터 증폭된 PCR 제품이 도시되고; 부정적인 제어, Nos의게놈 DNA -Cas9 부모 라인; 긍정적 인 제어, pDonor-bnl : 렉사 플라스미드; M, 마커 (SL2K DNA 사다리). (C) 마침줄에 대한 프라이머 M13F 및 rev3를 사용하여 예상되는 PCR 제품을 보여주는 스크리닝 젤의 예; M8-7 및 M9-6은 두 개의 엔드인 라인입니다. 음수 및 양수 컨트롤, B와 동일; M, 마커 (NEB 1 kb DNA 사다리). (D) BNL-LexA및 노스-Cas9 대조군으로부터의 총 RNA에 대한 RT-PCR 분석. 앞으로 프라이머는 LexA 특정 영역에 바인딩, 역 프라이머다운 스트림 bnl 엑슨 영역에 바인딩; ~440bp(베이스-페어) 증폭 대역(*)은 BNL-LexAmRNA에서 RT-PCR로부터 검출되었지만, 대조군 RNA로부터는 검출되지 않았다. M, 100 bp 마커 (NEB). 두 외에서 그림 2와 S1에서 적응. 2017. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| A. gRNA 복제 및 시퀀싱 | |
| bnl-렉사 gRNA fwd | 타타타가아가트가트CCGGGTGAACTTCGGTATCTGCGAT |
| GCCCCTCAGTTT타가GC타가타가타가타그카AGAG | |
| bnl-렉사 gRNA 레브 | ATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTAAACTCCCGCAATCTGAAGG |
| ATcGACGTTAAATTGAAAAATAGGTC | |
| 시퀀싱에 사용되는 T3 프라이머 | 카타 액트CACTAAAGG-3' |
| 참고: pCFD4 벡터에 대한 U6 프로모터 또는 gRNA 코어에 대한 음절 을 밑줄로 한 뉴클레오티드, 소문자 g/c가 첨가되어 U6 프로모터 의존적 전사를 돕기 위해 첨가되었습니다. | |
| B. HDR 기증자 건설 | |
| bnl N-F_pUC19 | AATTCGAGCTCGGTACtgtgtgtgctttgaggctggaac |
| bnl-렉사-N-R | tCCGcaagtCagtAGgctgccgcgtccgga GCCCGCAGAGACAAGGCCCCCC |
| 렉사-F | CTactGacttgCGGaGAtGGAtGGAAaaaACCCtGGC CCtATGCCACCCAAGAA가아가아가아GC |
| 렉사-R | CTAAACGAGTTAAGCAAAGACTCACTC |
| bnl 렉사-C Fwd | 타아아액트CGTT타가CG가그GTCAAC |
| bnl C-R_pUC19 | GCCAAGCTTGCATGCCtcgcataattgccgcgtg |
| 참고: 깁슨 어셈블리를 위한 pUC19 벡터와 자본 중첩되는 뉴클레오티드, 밑줄이 감싼 뉴클레오티드는 T2A 펩티드 첨가를 위한 서열 오버행하였다. | |
| C. HDR 스크리닝 및 시퀀싱 | |
| bnl-lexA scr fwd1 | GTGGCGCACCCAAAC |
| bnl-렉사 scr rev1 | 가트CCCAGCCAATCTCCGTTG |
| bnl-렉사 scr fwd2 | CAACG가가트그룽가트C |
| bnl-렉사 스크레브2 | CTGGCCAACTGTAGGGAAGTC |
| 엔드인 체크 레브3 | GCAATGTTGCAATGCGTGTTGAC |
| bnl-렉사 seq fwd3 | CACTTGTCGCCCATATT가타카ATTG |
| 참고: 이러한 프라이머는 PCR 스크리닝 및 시퀀싱에 사용되었으며, 프라이머 결합 부위의 대략적인 위치는 도 5A에 fwd1-2 및 rev1-3로 도시된다. | |
| D. RT-PCR 분석 | |
| RT-f | 가트가트가트CTCCGCTGCTG |
| RT-r | CCATGC가타카그카아그 |
표 1: 이 스터디에 사용되는 프라이머. (A)gRNA 발현 벡터 및 시퀀싱을 복제하기 위한 프라이머. (B)HDR 기증자 템플릿 복제에 대한 프라이머. (C)HDR 제품의 스크리닝 및 시퀀싱을 위한 프라이머. (D)키메라 렉사-bnl mRNA 제품의 RT-PCR 검증에 사용되는 프라이머.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | Molecular Biology |
| EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | Molecular Biology |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Molecular Biology |
| UltraPure DNase/RNase-Free Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | Molecular Biology |
| Primers | IDT-DNA | PCR | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | Molecular Biology |
| 2x PCR PreMix, with dye (red) | Sydlab | MB067-EQ2R | Molecular Biology |
| MKRS/TB6B | Kornberg lab | Fly line | |
| CO2 station | Genesee Scientific | 59-122WCU | fly pushing |
| Stereo microscope | Olympus | SZ-61 | fly pushing |
| Microtube homogenizing pestles | Fisher-Scientific | 03-421-217 | genomic DNA isolation |
