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Encyclopedia of Experiments

基因组修饰筛选:在果蝇中识别CRISPR生成突变体的方法

Overview

这段视频描述了一种识别转基因果蝇的筛选方法,其基因组使用CRISPR-Cas9进行了修改。CRISPR-Cas9是一种强大的基因组编辑工具,它彻底改变了科学家操纵生物体基因组的方式。在示例协议中,我们将看到如何识别 CRISPR 生成的突变体,其中插入交易激活序列取代了无分支(bnl)基因的第一个外出,从而创建一个bnl基因特定驱动系bnl-LexA。

Protocol

本协议摘自 Du等人,一个有效的策略,通过基因组编辑,J. Vis. Exp. (2018) 在果蝇中生成组织特定的二元转录系统。

1. 飞行遗传学和筛选(图1和图2)

  1. 当注射的胚胎发育成成人时,将每只G0 苍蝇交叉到平衡器苍蝇。为包含目标等位基因的染色体选择合适的平衡器。
  2. 麻醉F1后代从每个G0交叉在CO2 垫上,并随机挑选10-20雄性在立体显微镜下。如 图2所示,将它们单独交叉到平衡器女性。
  3. 当F2幼虫孵化时,从每个十字架上挑选单一的F1父亲,并使用单飞基因组DNA制备方案提取gDNA:
    1. 准备 gDNA 提取缓冲区:10 mM 特里斯-Cl pH 8.2、1 mM EDTA、25m NaCl,在室温下存储。准备20毫克/mL蛋白酶K库存溶液,并储存在冰箱里。
    2. 将每只苍蝇放入 1.5 mL 微型离心管中,并给管子贴上标签。保持在-80°C冰柜过夜。
    3. 准备含有200微克/mL最终浓度蛋白酶K的gDNA萃取缓冲器的新鲜工作量。
      注意:不要为此步骤使用旧缓冲区。
    4. 用装有 50μL 压扁缓冲器的移液器尖端将每只苍蝇挤压 10–15 s,无需分配液体。将剩余的缓冲区分配到管中并混合均好。在 37 °C 孵化 20–30 分钟。
    5. 将管放入 95 °C 热块中 1~2 分钟,以激活蛋白酶 K。
    6. 在 10,000 x g下旋转 5 分钟。将准备储存在 4 °C 以进行进一步的 PCR 分析。
  4. 使用相同的方法准备gDNA从nos-Cas9苍蝇,这是一个负控制。执行基于PCR的三步屏幕,以识别正确的"结束"HDR(图1,图3)使用每个F1男性的gDNA作为模板5。在以下 PCR 反应系统中使用 1μL 的 DNA 准备:10 μL 的 2 倍 PCR 主混合染料,每个引物的 1μL(10 μM)、1μL 的 DNA 模板和 7 μL 的 ddH2O。
  5. 如图3A所示,使用引物 fwd1 和 rev1 执行 PCR 以筛选插入或替换是否存在:使用fwd2和rev2引物执行PCR,以验证3'区域的插入或更换;使用引座 M13F 和 rev3 执行 PCR 以检查"结束"HDR(表 1C)。
  6. 保持飞行线与确认的结束HDR和建立平衡的股票从F2一代。再次飞向平衡器,以消除其他染色体上任何意外的突变。

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Representative Results

Figure 1
图1:CRISPR/Cas9介质基因组编辑的工作流程概述,以生成二进制转录系统。 指示每个步骤所需的大致时间。 请单击此处查看此图的更大版本。

Figure 2
图2:CRISPR筛选和建立基因组编辑的飞行线的基因交叉计划的例证。 在遗传交叉中,R 代表第3 染色体上的编辑等位基因。 MKRS (Tp (3:3) MRS, M (3) 76A [1] 卡尔 [1] ry [2] Sb[1]), 是第 染色体标记: TM6B( 在(3LR)TM6B中,安特普[胡]e[1]Tb[1])是第 染色体平衡器。从F2或F3一代苍蝇中提取的基因组DNA放大了目标感兴趣的区域,并按顺序确定PCR产品,从而验证了经过基因组编辑的苍蝇种群。 请单击此处查看此图的更大版本。

Figure 3
图3:由CRISPR/Cas9介质的exon替换生成bnl-LexA。 (A)描绘 CRISPR/Cas9 调解 HDR 在bnl轨迹中更换 exon 的策略的原理图。盒子 - 外起:线-直线:替代捐赠者(p捐赠者-bnl:LexA)和两个可能的结果的HDR显示。pDonor-bnl:LexA具有以下功能:(1) T2A-nls-LexA:p65 (~1.8kb) 序列,侧翼为 2 kb 和 1.8 kb 长同源臂(虚线)(已折断的线条)(以下)2) 残余 N 终端bnl exon 和nls-LexA:p65之间的 T2A 自切肽,以及 (3) nls-LexA:p65序列之后的翻译停止 codon (红色 *) 。HDR 产品保留了bnl的所有转录和转录后控制,LexA:p65蛋白质的产生模式与内源 Bnl 相同。 小黑箭头显示用于 3 步筛选或 RT-PCR 验证的 PCR 引物 (表 1)的相对绑定位(非比例)。(B)阿加罗斯凝胶图片显示三步 PCR 筛查的结果。显示从四条成功的末端 HDR 线的基因组 DNA 中放大的 PCR 产品:负控制,nos-Cas9父系的基因组DNA:正控制, p 捐赠者 -bnl: 莱克萨质粒:M, 标记 (SL2K DNA 阶梯)。(C)使用引物 M13F 和转速 3 表示预期 PCR 产品的筛选凝胶示例:M8-7和M9-6是两个终点线:负控和正控,与 B 中相同:M, 标记 (NEB 1 kb 脱氧核糖核酸梯)。(D) RT-PCR分析来自bnl-LexAnos-Cas9控制苍蝇的总RNA。转发引言绑定到LexA特定区域,反向引引器绑定到下游bnl exon 区域;在bnl-LexAmRNA 上的 RT-PCR 中检测到约 440 bp(碱基对)放大带 (*),但未从控制 RNA 检测到。M, 100 bp 标记 (NEB)。改编自图2和S1在杜等人。2017.请单击此处查看此图的更大版本。

A. gRNA 克隆和测序
布尔-莱克斯阿格纳·弗德 塔加塔塔克格特格特克特克特格特克特克加特
克特克特卡格塔加加塔加塔加格
bnl - 莱克斯阿 grna 转速 阿塔克特克特加格
阿克特加格塔塔格塔格特
用于测序的 T3 入门 卡塔阿卡塔格-3'
注: 核苷酸在pCFD4载体上的U6促进剂或gRNA核心下划线,小写g/c被添加以帮助U6促进者依赖转录
B. HDR 捐赠者构建
bnl N - F_pUC19 阿塔特加格特塔克特克特加克
bnl - 莱克斯 - 恩 - r 特加格特·卡格特格特克格特克特克加
格卡加塔卡格
莱卡-F 克特克特克加特格特加克
中加卡加加加
莱卡-R 卡塔阿克加格塔格卡卡特
bnl 莱克斯 - C · 弗德 塔克特格特·塔加特·格格特·格特卡奇
bnl C - R_pUC19 格卡格茨克特克茨卡塔特克
注: 资本中的核苷酸与吉布森大会的pUC19载体重叠,核苷酸下划线为T2A肽添加序列悬垂。
C. HDR 筛查和测序
bnl-莱克斯萨·斯克尔·弗德1 格格奇卡卡塔克
bnl - 莱克斯萨 · 斯克雷夫 1 关贸总协定
bnl-莱克斯萨·斯克尔·弗德2 卡卡加加特加特
bnl-莱克斯萨斯克尔转速2 克特卡塔格加格特
结束检查转速3 加特格塔特加特加克
bnl-莱克斯·塞克·弗德3 卡奇特克特卡特加塔卡特
注: 这些引物用于 PCR 筛选和测序,引物绑定站点的大致位置以 fwd1-2 和 rev1-3 显示在图 5A 中。
D. RT-PCR 分析
Rt - f 加塔加特克
Rt - r 卡卡加加塔卡格卡格特格

表1:本研究中使用的引言。A) 克隆gRNA表达向量和测序的引言。(B) 克隆 HDR 捐赠者模板的引物。(C) 用于对 HDR 产品进行筛选和排序的引物。(D) 用于 RT-PCR 验证奇美 莱克萨 -bnl mRNA 产品的引物。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris-HCl Sigma Aldrich T3253 Molecular Biology
EDTA Sigma Aldrich E1161 Molecular Biology
NaCl Sigma Aldrich S7653 Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water ThermoFisher Scientific 10977-023 Molecular Biology
Primers IDT-DNA PCR
Proteinase K ThermoFisher Scientific 25530049 Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red) Sydlab MB067-EQ2R Molecular Biology
MKRS/TB6B Kornberg lab Fly line
CO2 station Genesee Scientific 59-122WCU fly pushing
Stereo microscope Olympus SZ-61 fly pushing
Microtube homogenizing pestles Fisher-Scientific 03-421-217 genomic DNA isolation

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