Overview
このビデオでは、CRISPR-Cas9を使用してゲノムを改変したトランスジェニックショウジョウバエを同定するスクリーニング方法について説明します。CRISPR-Cas9は、科学者が生物のゲノムを操作する方法に革命を起こした強力なゲノム編集ツールです。プロトコル例では、TRANSActivationシーケンスの挿入が分岐のない(bnl)遺伝子の最初のエキソンに取って代わるCRISPR生成変異体を同定する方法を見て、bnl-LexAというbnl遺伝子特異的ドライバラインを作成する。
Protocol
このプロトコルは、ゲノム編集、J.Vis. Exp.(2018)によるショウジョウバエにおける組織特異的バイナリ転写システムを生成するための効率的な戦略であるDu et al.からの抜粋である。
1. 飛ぶ遺伝学とスクリーニング(図1および図2)
- 注入された胚が成人に発達すると、各単一のG0 ハエを横切ってバランサハに飛ぶ。標的となるアリールを含む染色体に適したバランサーを選択します。
- CO2 パッド上の各G0クロスからF1子孫を麻酔し、ステレオ顕微鏡で10〜20人の雄を無作為に選びます。 図 2に示すように、それらを個別にバランサ メスに渡します。
- F2幼虫が孵化したら、各十字架から単一のF1父親を選び、単一のフライゲノムDNA調製プロトコルを使用してgDNAを抽出します。
- gDNA抽出バッファーを準備する:10 mM Tris-Cl pH 8.2、1 mM EDTA、25 mM NaCl、室温で保管します。20 mg/mL プロテイナーゼ K ストック溶液を準備し、冷凍庫に保管します。
- 各フライを1.5 mLのマイクロ遠心分離チューブに入れ、チューブにラベルを付けます。-80°Cの冷凍庫に一晩保管してください。
- 200 μg/mL 最終濃度のプロテナーゼKを含むgDNA抽出バッファーの新しい作業量を準備します。
注: このステップには古いバッファーを使用しないでください。 - 液体を分配せずに50 μLのスクッシュングバッファを含むピペットチップを備えた10~15 sのフライをそれぞれ押しつぶします。残りのバッファーをチューブに分配し、よく混ぜます。37 °Cで20~30分間インキュベートします。
- チューブを95°Cのヒートブロックに1〜2分間入れて、プロテアーゼKを不活性化します。
- 10,000 x gで5分間スピンダウンします。PCR分析を進めるには、4°Cで調製してください。
- 同じ方法で、負のコントロールとして機能するnos-Cas9フライからgDNAを調製します。3段階PCRベースの画面を実行して、各F1雄のgDNAをテンプレート5として使用して、正しい「エンドアウト」HDR(図1、図3)を特定します。次のPCR反応系で1μLのDNA調製を使用:2倍PCRマスターミックスの10 μLと色素、1μLの各プライマー(10 μM)、1 μLのDNAテンプレート、および7 μLのddH2Oを使用します。
- 図 3Aに示すように、プライマー fwd1 および rev1 を使用して PCR を実行して、挿入または置換の有無を確認します。3' 領域からの挿入または置換を検証するために fwd2 および rev2 プライマーを使用して PCR を実行する。プライマー M13F および rev3 を使用して PCR を実行して、HDR の「エンドイン」をチェックします (表 1C)。
- 確認済みのエンドアウト HDR でフライラインを維持し、F2 世代のバランスの取れた在庫を確立します。バランサへのアウトクロスは、他の染色体の意図しない突然変異を取り除くために再び飛びます。
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Representative Results
図1:CRISPR/Cas9媒介ゲノム編集のワークフローの概要を示し、バイナリ転写システムを生成する。 各ステップに必要なおおよその所要時間が示されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ゲノム編集フライラインを確立するためのCRISPRスクリーニングと遺伝的クロススキームの図。 遺伝的十字架では、Rは3番目 の染色体にある編集されたアレーレを表します。 MKRS (Tp(3;3)MRS、M(3)76A[1]の[1]ry[2]Sb[1])は、3番目 の染色体マーカーです。 TM6B (In(3LR)TM6B、Antp[Hu] e[1] Tb[1]) は3番目 の染色体バランサーです。ゲノム編集されたフライ株は、F2またはF3生成型ハエから抽出されたゲノムDNAから目的の標的領域を増幅し、PCR産物を配列決定することによって検証される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:CRISPR/Cas9媒介エキソン交換によるbnl-LexAの生成(A) CRISPR/Cas9の戦略を描いた模式図は、bnl遺伝子座におけるエキソン置換のためのHDRを仲介した。ボックス - エキソン。ライン - イントロン;交換ドナー(pDonor-bnl:LexA)およびHDRの2つの可能な結果が示された。pDonor-bnl:LexAは次の機能を持っていました: (1) T2A-nls-LexA:p65 (〜1.8kb) シーケンスは、2 kb および 1.8 kb の長いホモロジーアーム (破線) で横たわっています。 ) 残留 N 末端bnlエキソンとnls-LexA:p65の間の T2A 自己切断ペプチド 、および (3) nls-LexA:p65配列の後の翻訳停止コドン (赤 *) 。HDR産物はbnlの転写および転写後のすべての制御を保持し、LexA:p65タンパク質は内因性Bnlと同じパターンで産生されると予想される。(B)3段階PCRスクリーニングの結果を示すアガロースゲル写真。4つの成功したエンドアウトHDRラインのゲノムDNAから増幅されたPCR産物が示されている。陰性対照、nosのゲノムDNA -Cas9親のライン;陽性コントロール, pDonor -bnl:LexAプラスミド;M、マーカー(SL2K DNAラダー)。(c)エンドインライン用プライマー M13F および rev3 を使用して期待される PCR 産物を示すスクリーニングゲルの例M8-7 と M9-6 は 2 つの終端ラインです。B と同じ負と正のコントロール。M、マーカー(NEB 1 kb DNAラダー)。(D) bnl-LexAおよびnos-Cas9制御ハエからの総RNAに関するRT-PCR分析。フォワードプライマーはLexA固有の領域に結合し、逆プライマーは下流のbnlエキソン領域に結合する。〜440 bp(塩基対)増幅バンド(*)は、コントロールRNAからではなくbnl-LexAmRNA上のRT-PCRから検出された。M,100bpマーカー(NEB)。Duらの図2およびS1から適応する。2017.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| A. gRNA クローニングとシーケンシング | |
| bnl-lexA gRNA fwd | タタタガタッグクトグガクトグクトクガト |
| GCCCCTCAGTTTTAGAGCTAGAAAタグカーグ | |
| bnl-lexA gRNA rev | アトッタアクティクトタットタグクトアアアクテッカハッカルテクトガーグ |
| アツガクトゥッタットガーアタグ | |
| シーケンシングに使用されるT3プライマー | カアッタ・アクトカターグ3' |
| 注: ヌクレオチドは、pCFD4ベクター上のU6プロモーターまたはgRNAコアにアニールを下線し、U6プロモーター依存性転写を助けるために小文字g/cを追加した | |
| B. HDRドナーの建設 | |
| bnl N-F_pUC19 | アトックガグCGGTACtgtgttgtgcggaac |
| bnl-レキサ-N-R | tCCGcAagtCagtAGgctgccgcgtttcgtcggggga グマクGCガガタカアグマクシュ |
| レックスA-F | クタクトガクトグCGガガガットグッガッカアッガクCtC ククタクトGCカマカアガアガーGC |
| レックス・R | クアラクガグットッタアグカアアクチャクトク |
| bnl レキサ-C Fwd | ターアアアクツタガCGGGGGGTGTGTGTCAAC |
| bnl C-R_pUC19 | GCCAAGCTGCGCCtctcgaattgccgttggtggtgg |
| 注: 資本中のヌクレオチドは、ギブソンアセンブリのpUC19ベクターと重複し、下線が引かれたヌクレオチドは、T2Aペプチド付加のための配列オーバーハングであった。 | |
| C. HDR のスクリーニングとシーケンシング | |
| bnl-lexA scr fwd1 | GTGGCGCACCCCAAAAC |
| bnl-lexA scr rev1 | ガトカガクチャククトグ |
| bnl-lexA scr fwd2 | カアCGガガットッググガッチ |
| bnl-lexA scr rev2 | CTGGCCAACTGTAGGGAAGTC |
| 終了チェック rev3 | GCAATGTATGCGTGTTGAC |
| bnl-lexA セクfwd3 | サクトクトグクマクマクハタットガタカート |
| 注: これらのプライマーはPCRスクリーニングおよびシーケンシングに用いられ、プライマー結合部位の近似位置をfwd1-2およびrev1-3として図5Aに示す。 | |
| D. RT-PCR 分析 | |
| RT-f | ガタガットットクトククトククトクトテクトグ |
| RT-r | カチカラガガカガグカグクグ |
表1:本研究で使用したプライマー(A)gRNA発現ベクターおよびシーケンシングをクローニングするためのプライマー。(B) HDRドナーテンプレートのクローニング用プライマー。(C) HDR 製品のスクリーニングとシーケンシング用プライマー。(D) キメラLexA-bnl mRNA 産物の RT-PCR 検証に使用するプライマー。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | Molecular Biology |
| EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | Molecular Biology |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Molecular Biology |
| UltraPure DNase/RNase-Free Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | Molecular Biology |
| Primers | IDT-DNA | PCR | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | Molecular Biology |
| 2x PCR PreMix, with dye (red) | Sydlab | MB067-EQ2R | Molecular Biology |
| MKRS/TB6B | Kornberg lab | Fly line | |
| CO2 station | Genesee Scientific | 59-122WCU | fly pushing |
| Stereo microscope | Olympus | SZ-61 | fly pushing |
| Microtube homogenizing pestles | Fisher-Scientific | 03-421-217 | genomic DNA isolation |
