Genomik Modifikasyonların Taranması: Drosophila'da CRISPR Tarafından Üretilen Mutantları Tanımlama Yöntemi

Overview

Bu videoda, genomu CRISPR-Cas9 kullanılarak değiştirilen transgenik Drosophila sineklerini tanımlamak için bir tarama yöntemi açıklanmaktadır. CRISPR-Cas9, bilim adamlarının bir organizmanın genomunu manipüle etme biçiminde devrim yapan güçlü bir genom düzenleme aracıdır. Örnek protokolde, bir transaktivasyon dizisinin eklenmesinin dalsız (bnl) genin ilk eksonunun yerini aldığı CRISPR tarafından oluşturulan mutantların nasıl tanımlanacağını göreceğiz, böylece bnl gene özgü bir sürücü hattı olan bnl-LexA.

Protocol

Bu protokol, Genom Düzenleme, J. Vis. Exp. (2018) tarafından Drosophila'da Dokuya Özgü İkili Transkripsiyon Sistemleri Üretmek için Etkili Bir Strateji olan Du ve ark.'danbir alıntıdır.

1. Sinek genetiği ve taraması (Şekil 1 ve Şekil 2)

1. Enjekte edilen embriyolar yetişkinlere dönüştüğünde, dengeleyici sineklere her bir G₀ sinekini geçin. Hedeflenen aleleyi içeren kromozom için uygun dengeleyiciyi seçin.
2. Her G0 çaprazından F1 yavrularını bir CO₂ pedinde uyuşturun ve stereomikroskop altında rastgele 10-20 erkek seçin. Şekil 2'degösterildiği gibi dengeleyici dişilere tek tek geçin.
3. F2 larvaları yumurtadan çıktığında, her haçtan tek F1 babasını seçin ve tek sinek genomik DNA hazırlama protokolünü kullanarak gDNA çıkarın:
   1. GDNA ekstraksiyon tamponunu hazırlayın: 10 mM Tris-Cl pH 8.2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, oda sıcaklığında saklayın. 20 mg/mL Proteinaz K stok çözeltisi hazırlayın ve dondurucuda saklayın.
   2. Her sineği 1,5 mL mikro santrifüj tüpüne koyun ve tüpü etiketleyin. Gece boyunca -80 °C dondurucuda tutun.
   3. Proteinaz K'nin 200 μg/mL son konsantrasyonu içeren yeni bir gDNA ekstraksiyon tamponu hazırlama.
      Not: Bu adım için eski bir arabellek kullanmayın.
   4. Sıvıyı dağıtmadan 50 μL ezme tamponu içeren bir pipet ucu ile her bir sineği 10-15 sn boyunca ezin. Kalan tamponu tüpe dağıtın ve iyice karıştırın. 20-30 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
   5. Proteinaz K'yi devre dışı bırakmak için tüpleri 1-2 dakika boyunca 95 °C ısı bloğuna koyun.
   6. 10.000 x g'da5 dakika aşağı dön. Daha fazla PCR analizi için hazırlığı 4 °C'de saklayın.
4. Negatif kontrol görevi gören bir nos-Cas9 sineğinden gDNA hazırlamak için aynı yöntemi kullanın. Her F1 erkeğinin gDNA'sını şablon olarak kullanarak doğru "uçlar" HDR'yi (Şekil 1, Şekil 3) tanımlamak için üç adımlı PCR tabanlı ekranlar gerçekleştirin⁵. Aşağıdaki PCR reaksiyon sisteminde 1 μL DNA hazırlığı kullanın: Boya ile 10 μL 2x PCR Master Mix, her astarın 1 μL'si (10 μM), 1 μL DNA şablonu ve 7 μL ddH₂O.
5. Şekil 3A'dagösterildiği gibi, ekleme veya değiştirmenin varlığını taramak için fwd1 ve rev1 astarlarını kullanarak PCR gerçekleştirin; 3' bölgesinden ekleme veya değiştirme işlemini doğrulamak için fwd2 ve rev2 astarlarını kullanarak PCR gerçekleştirmek; "End-in" HDR'yi(Tablo 1C)kontrol etmek için M13F ve rev3 astarlarını kullanarak PCR gerçekleştirin.
6. Onaylanan uçucu HDR ile uçuş hatlarını koruyun ve F2 neslinden dengeli stoklar oluşturun. Dengeleyiciye giden dış uçlar, diğer kromozomlardaki istenmeyen mutasyonları gidermek için tekrar uçar.

Representative Results

Şekil 1: İkili transkripsiyon sistemi oluşturmak için CRISPR/Cas9 aracılı genom düzenleme iş akışına genel bakış. Her adım için gereken yaklaşık süre belirtilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Genomla düzenlenmiş sinek hatları oluşturmak için CRISPR taraması ve genetik çapraz şemanın bir örneği. Genetik haçlarda R, 3^rd kromozom üzerinde bulunan düzenlenmiş alele anlamına gelir. MKRS (Tp(3;3)MRS, M(3)76A[1] kar[1] ry[2] Sb[1]), 3^rd kromozom işaretleyicidir; TM6B (In(3LR)TM6B, Antp[Hu] e[1] Tb[1]), 3^rd kromozom dengeleyicidir. Genom düzenlenmiş sinek stokları, F2 veya F3 nesil sineklerden çıkarılan genomik DNA'dan ve PCR ürünlerini belirleyen diziden hedeflenen ilgi alanlarını güçlendiren PCR ile doğrulanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: CRISPR/Cas9 aracılı ekson değişimi ile bnl-LexA üretimi. (A) Bnl locus'ta exon değişimi için CRISPR/Cas9 aracılı HDR stratejisini gösteren şematik çizim. Kutu - exon; hat-intron; yedek donör (pDonor-bnl:LexA)ve HDR'nin iki olası sonucu gösterildi. pDonor-bnl:LexA aşağıdaki özelliklere sahipti: (1) T2A-nls-LexA:p65 (~1.8kb) dizisi 2 kb ve 1.8 kb uzun homoloji kolları (kesik çizgiler), (kesik çizgiler) ile çevrili 2) artık N terminali bnl exon ve nls-LexA:p65arasında bir T2A kendinden bölünen peptit ve (3) nls-LexA:p65 dizisinden sonra bir çeviri durağı kodon (kırmızı *). HDR ürünü bnl'nintüm transkripsiyonel ve transkripsiyon sonrası kontrolünü korudu ve LexA:p65 proteininin endojen Bnl ile aynı desende üretilmesi bekleniyor. (B) 3 adımlı PCR taramasının sonuçlarını gösteren agarose jel resimleri. Dört başarılı uçlu HDR çizgisinin genomik DNA'sından güçlendirilmiş PCR ürünleri gösterilir; negatif kontrol, nos-Cas9 ebeveyn hattının genomik DNA'sı; pozitif kontrol, pDonor-bnl:LexA plazmid; M, Marker (SL2K DNA merdiveni). (C) Uçlu hatlar için Astarlar M13F ve rev3 kullanarak beklenen PCR ürününü gösteren eleme jeli örneği; M8-7 ve M9-6 iki uçlu çizgidir; olumsuz ve pozitif kontroller, B'de olduğu gibi; M, Marker (NEB 1 kb DNA merdiveni). (D) bnl-LexA'dan toplam RNA üzerinde RT-PCR analizi ve nos-Cas9 kontrolü uçar. İleri astar LexA'ya özgü bir bölgeye bağlanır, ters astar aşağı akış bnl ekson bölgesine bağlanır; bnl-LexAmRNA'daki RT-PCR'den ~440 bp (baz çifti) amplifikasyon bandı (*) tespit edildi, ancak kontrol RNA'sından algılanmadı. M, 100 bp İşaretleyici (NEB). Du ve ark.'daki Şekil 2 ve S1'den uyarlanmıştır. 2017. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

A. gRNA klonlama ve sıralama
bnl-lexA gRNA fwd	TATATAGGAAGATATCCGGGTGAACTTCGTGTATCTGCGAT
	GCCCCTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
bnl-lexA gRNA rev	ATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTAAAACTCCCGCAATCTGAAGG
	ATcGACGTTAAATTGAAAATAGGTC
Sıralama için kullanılan T3 astar	CAATTA ACCCTCACTAAAGG-3'
NOT: nükleotidler pCFD4 vektöründe U6 promotörüne veya gRNA çekirdeğine altı çizili tavlama, U6 promotöre bağımlı transkripsiyona yardımcı olmak için küçük g/ c eklendi
B. HDR donör yapımı
bnl N-F_pUC19	AATTCGAGCTCGGTACtgtggtctgaggctggaac
bnl-lexA-N-R	tCCGcaagtCagtAGgctgccgcgtccttcgccgga GCCCGCAGATACAAGGCCCC
lexA-F	CTactGacttgCGGaGAtTcGAaGAGAACCCtGGC CCtATGCCACCCAAGAAGAAGC
lexA-R	CTAAACGAGTTTTTAAGCAAACTCACTC
bnl lexA-C Fwd	TAAAAACTCGTTTAGACGGGGGGGGGTTGTCAAC
bnl C-R_pUC19	GCCAAGCTTGCATGCCtcgcataattgccgcctgg
NOT: Sermayedeki nükleotitler Gibson Assembly için pUC19 vektörü ile çakışıyor, altı çizili nükleotidler T2A peptit ilavesi için sıra çıkıntısıydı.
C. HDR tarama ve sıralama
bnl-lexA scr fwd1	GTGGCGCACGCCCAATAAAC
bnl-lexA scr rev1	GATCCCAGCCAATCTCCGTTG
bnl-lexA scr fwd2	CAACGGAGATTGGCTGGGATC
bnl-lexA scr rev2	CTGGCCAACTGTAGGGAAGTC
bitiş denetimi rev3	GCAATGTTATGCAATGCGTTGAC
bnl-lexA seq fwd3	CACTTGTCGCCCATATTGATACAATTG
NOT: Bu astarlar PCR taraması ve dizilimi için kullanıldı, astar bağlama alanlarının yaklaşık konumları Şekil 5A'da fwd1-2 ve rev1-3 olarak gösterilmiştir.
D. RT-PCR analizi
RT-f	GATATGGATTTCTCCGCTTTGCTG
RT-r	CCATGCAGAGATACAGGCAAGTG

Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan primerler. (A) gRNA ifade vektörü ve dizilim klonlama için astarlar. (B) HDR donör şablonlarını klonlamak için astarlar. (C) HDR ürünlerinin taranmasını ve sırasını oluşturmak için astarlar. (D) Kimerik LexA-bnl mRNA ürününün RT-PCR doğrulaması için kullanılan astarlar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Molecular Biology
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Molecular Biology
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water	ThermoFisher Scientific	10977-023	Molecular Biology
Primers	IDT-DNA		PCR
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red)	Sydlab	MB067-EQ2R	Molecular Biology
MKRS/TB6B	Kornberg lab		Fly line
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU	fly pushing
Stereo microscope	Olympus	SZ-61	fly pushing
Microtube homogenizing pestles	Fisher-Scientific	03-421-217	genomic DNA isolation