Screening op genomische modificaties: een methode om CRISPR-gegenereerde mutanten in Drosophila te identificeren

Overview

Deze video beschrijft een screeningsmethode om transgene Drosophila-vliegen te identificeren, waarvan het genoom is gewijzigd met CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 is een krachtige genoombewerkingstool die een revolutie teweegbracht in de manier waarop wetenschappers het genoom van een organisme kunnen manipuleren. In het voorbeeldprotocol zullen we zien hoe crispr-gegenereerde mutanten kunnen worden geïdentificeerd, waarbij het inbrengen van een transactiveringssequentie de eerste exon van het branchless (bnl) gen vervangt, waardoor een bnl-genspecifieke driverlijn ontstaat, bnl-LexA.

Protocol

Dit protocol is een fragment uit Du et al., An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing, J. Vis. Exp. (2018).

1. Vlieggenetica en screening (figuur 1 en figuur 2)

1. Wanneer de geïnjecteerde embryo's zich ontwikkelen tot volwassenen, kruis dan elke enkele G_0-vliegen naar balancervliegen. Selecteer een geschikte balancer voor het chromosoom dat het beoogde allel bevat.
2. Verdoof de F1-nakomelingen van elk G0-kruis op een CO_2-pad en pluk willekeurig 10-20 mannetjes onder een stereomicroscoop. Kruis ze afzonderlijk aan de balancervrouwen zoals weergegeven in figuur 2.
3. Wanneer de F2-larven uitkomen, kiest u de enige F1-vader uit elk kruis en extraheert u gDNA met behulp van het genomische DNA-voorbereidingsprotocol met één vlieg:
   1. Bereid gDNA extractiebuffer: 10 mM Tris-Cl pH 8.2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, bewaren bij kamertemperatuur. Bereid 20 mg/ml Proteinase K voorraadoplossing en bewaar in de vriezer.
   2. Doe elke vlieg in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en label de buis. 's Nachts in de vriezer van -80 °C bewaren.
   3. Bereid een nieuw werkvolume gDNA-extractiebuffer voor met een eindconcentratie van 200 μg/ml Proteïnase K.
      Opmerking: Gebruik geen oude buffer voor deze stap.
   4. Squish elke vlieg gedurende 10-15 s met een pipetpunt met 50 μL squishing buffer zonder de vloeistof te doseren. Verdeel de resterende buffer in de buis en meng goed. Incubeer bij 37 °C gedurende 20-30 minuten.
   5. Doe de buizen 1-2 minuten in een hitteblok van 95 °C om de Proteinase K te inactiveren.
   6. Draai 5 min naar beneden op 10.000 x g. Bewaar de bereiding bij 4 °C voor verdere PCR-analyse.
4. Gebruik dezelfde methode om gDNA voor te bereiden van een nos-Cas9 vlieg, die dient als een negatieve controle. Voer pcr-schermen in drie stappen uit om de juiste "ends out" HDR (figuur 1, figuur 3) te identificeren met gDNA van elke F1-man als sjabloon⁵. Gebruik 1 μL van de DNA prep in het volgende PCR-reactiesysteem: 10 μL 2x PCR Master Mix met Dye, 1 μL van elke primer (10 μM), 1 μL DNA-sjabloon en 7 μL ddH₂O.
5. Zoals weergegeven in figuur 3A, voert u PCR uit met primers fwd1 en rev1 om te screenen op het bestaan van de invoeging of vervanging; pcr uit te voeren met behulp van fwd2- en rev2-primers om de invoeging of vervanging uit de 3'-regio te controleren; voer PCR uit met primers M13F en rev3 om "ends-in" HDR (Tabel 1C) te controleren.
6. Houd de vlieglijnen met de bevestigde ends-out HDR en stel evenwichtige voorraden van de F2-generatie vast. Outcross naar de balancer vliegt weer om onbedoelde mutaties op andere chromosomen te verwijderen.

Representative Results

Figuur 1: Een overzicht van de workflow voor CRISPR/Cas9-gemedieerde genoombewerking om een binair transcriptiesysteem te genereren. De geschatte tijdsduur die nodig is voor elke stap wordt aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Een illustratie van de CRISPR-screening en het genetische kruisschema voor het vaststellen van genoom-bewerkte vlieglijnen. In genetische kruisen staat R voor het bewerkte allel dat zich op het^3e chromosoom bevindt. MKRS (Tp(3;3)MRS, M(3)76A[1] kar[1] ry[2] Sb[1]), is een 3^rd chromosoommarker; TM6B (In(3LR)TM6B, Antp[Hu] e[1] Tb[1]) is een 3^rd chromosoom balancer. Genoom bewerkte vliegvoorraden worden geverifieerd door PCR ter versterking van de doelgebieden van belang uit het genomische DNA geëxtraheerd uit de F2- of F3-generatievliegen en de volgorde die de PCR-producten bepaalt. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3: Generatie van bnl-LexA door CRISPR/Cas9-gemedieerde exonvervanging. (A) Schematische tekening met de strategie van de CRISPR/Cas9 gemedieerde HDR voor exonvervanging in de bnl-locus. Doos - exon; lijn-intron; vervangende donor (pDonor-bnl:LexA) en twee mogelijke uitkomsten van de HDR werden getoond. De pDonor-bnl:LexA had de volgende kenmerken: (1) T2A-nls-LexA:p65 (~1.8kb) sequentie geflankeerd door 2 kb en 1.8 kb lange homologie armen (onderbroken lijnen), (2) een T2A zelf-splijtend peptide tussen de resterende N terminal bnl exon en de nls-LexA:p65 , en (3) een vertaling codon Het HDR-product behield alle transcriptie- en posttranscriptiecontrole van bnl, en het LexA:p65-eiwit zal naar verwachting in hetzelfde patroon worden geproduceerd als endogene Bnl. Kleine zwarte pijlen tonen de relatieve bindingsplaatsen (niet in schaal) van de PCR-primers (tabel 1) die worden gebruikt voor 3-staps screening of RT-PCR-validatie. (B) Agarose gel foto's met resultaten van de 3-staps PCR screening. PCR-producten versterkt uit het genomische DNA van vier succesvolle ends-out HDR-lijnen worden getoond; negatieve controle, het genomische DNA van de NOS-Cas9 ouderlijke lijn; positieve controle, pDonor-bnl:LexA plasmide; M, Marker (SL2K DNA ladder). (C) Een voorbeeld van de zeefgel die het verwachte PCR-product toont met primers M13F en rev3 voor eindlijnen; M8-7 en M9-6 zijn twee eindlijnen; negatieve en positieve controles, dezelfde als in B; M, Marker (NEB 1 kb DNA ladder). (D) RT-PCR analyse van de totale RNA van bnl-LexA en de nos-Cas9 controlevliegen. Forward primer bindt aan een LexA specifiek gebied, reverse primer bindt aan een downstream bnl exon regio; ~440 bp (base-pair) versterkingsband (*) werd gedetecteerd vanuit RT-PCR op bnl-LexAmRNA, maar niet vanuit het besturings-RNA. M, 100 bp Marker (NEB). Aangepast van figuren 2 en S1 in Du et al. 2017. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

A. gRNA klonen en sequencing
bnl-lexA gRNA fwd	TATATAGGAAAGATATCCGGGTGAACTTCgTGTATCTGCGAT
	GCCCCTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
bnl-lexA gRNA toeren	ATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTCCCGCAATATCTGAAGG
	ATcGACGTTAAATTGAAAATAGGTC
T3 primer gebruikt voor sequencing	CAATTA ACCCTCACTAAAGG-3'
OPMERKING: nucleotiden onderstreept gloeien naar U6 promotor of gRNA kern op pCFD4 vector, de kleine letters g/c werd toegevoegd om U6 promotor-afhankelijke transcriptie te helpen
B. HDR-donorconstructie
bnl N-F_pUC19	AATTCGAGCTCGGTACtgtggtctttgaggggggaac
bnl-lexA-N-R	tCCGcaagtCagtAGgctgccgcgtccttcgccgga GCCCGCAGATACAAGGCCCC
LexA-F	CTactGacttgCGGaGAtGTcGAaGAGAACCCtGGC CCtATGCCACCCAAGAAGAAGC
LexA-R	CTAAACGAGTTTTTAAGCAAACTCACTCACTC
bnl lexA-C Fwd	TAAAAACTCGTTTAGACGGGATGGCGTTGTCAAC
bnl C-R_pUC19	GCCAAGCTTGCATGCCtcgcataattgccgcctgg
OPMERKING: nucleotiden in hoofdletter overlap met pUC19 vector voor Gibson Assembly, nucleotiden onderstreept waren sequentie overhang voor T2A peptide toevoeging.
C. HDR-screening en sequencing
bnl-lexEen scr fwd1	GTGGCGCACGCCCAATAAAC
bnl-lexEen scr rev1	GATCCCAGCCAATCTCCGTTG
bnl-lexEen scr fwd2	CAACGGAGATTGGCTGGGATC
bnl-lexEen scr rev2	CTGGCCAACTGTAGGGAAGTC
ends-in cheque rev3	GCAATGTTATGCAATGCGTTGAC
bnl-lexEen seq fwd3	CACTTGTCGCCCATATTGATACAATTG
OPMERKING: Deze primers werden gebruikt voor PCR-screening en sequencing, de geschatte locaties van primerbindingslocaties worden weergegeven in figuur 5A als fwd1-2 en rev1-3.
D. RT-PCR-analyse
RT-f	GATATGGATTTCTCCGCTTTGCTG
RT-r	CCATGCAGAGATACAGGCAAGTG

Tabel 1: Primers gebruikt in deze studie. (A) Primers voor het klonen van gRNA expressie vector en sequencing. (B) Primers voor het klonen van HDR-donorsjabloon. (C) Primers voor screening en sequencing van de HDR-producten. (D) Primers die worden gebruikt voor RT-PCR-verificatie van het chimerische LexA-bnl mRNA-product.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Molecular Biology
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Molecular Biology
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water	ThermoFisher Scientific	10977-023	Molecular Biology
Primers	IDT-DNA		PCR
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red)	Sydlab	MB067-EQ2R	Molecular Biology
MKRS/TB6B	Kornberg lab		Fly line
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU	fly pushing
Stereo microscope	Olympus	SZ-61	fly pushing
Microtube homogenizing pestles	Fisher-Scientific	03-421-217	genomic DNA isolation