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Encyclopedia of Experiments

Screening auf Genommodifikationen: Eine Methode zur Identifizierung von CRISPR-generierten Mutanten in Drosophila

Overview

Dieses Video beschreibt eine Screening-Methode zur Identifizierung transgener Drosophila-Fliegen, deren Genom mit CRISPR-Cas9 modifiziert wurde. CRISPR-Cas9 ist ein leistungsstarkes Genom-Editing-Tool, das die Art und Weise revolutioniert hat, wie Wissenschaftler das Genom eines Organismus manipulieren können. Im Beispielprotokoll werden wir sehen, wie CRISPR-generierte Mutanten identifiziert werden können, bei denen ein Einfügen einer Transaktivierungssequenz das erste Exon des zweiglosen (bnl) Gens ersetzt und so eine bnl-genspezifische Treiberlinie, bnl-LexA, erzeugt.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Du et al.,An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing, J. Vis. Exp. (2018).

1. Fliegengenetik und Screening (Abbildung 1 und Abbildung 2)

  1. Wenn sich die injizierten Embryonen zu Erwachsenen entwickeln, kreuzen Sie jede einzelne G 0-Fliegen, um Diefliegtzuder zu werden. Wählen Sie den geeigneten Balancer für das Chromosom aus, das das Zielallel enthält.
  2. Anästhetisieren Sie die F1-Nachkommen von jedem G0-Kreuz auf einem CO2-Pad und wählen Sie zufällig 10-20 Männchen unter einem Stereomikroskop. Kreuzen Sie sie einzeln zu den Balancer-Weibchen, wie in Abbildung 2dargestellt.
  3. Wenn die F2-Larven schlüpfen, wählen Sie den einzelnen F1-Vater aus jedem Kreuz und extrahieren sie gDNA mit dem genomischen DNA-Vorbereitungsprotokoll:
    1. Bereiten Sie gDNA Extraktionspuffer: 10 mM Tris-Cl pH 8.2, 1 mMEDTA, 25 mM NaCl, Lager bei Raumtemperatur. 20 mg/ml Proteinase K Vorrat aufbereiten und im Gefrierschrank aufbewahren.
    2. Legen Sie jede Fliege in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und beschriften Sie das Rohr. Über Nacht im Gefrierschrank von -80 °C aufbewahren.
    3. Bereiten Sie ein frisches Arbeitsvolumen des gDNA-Extraktionspuffers vor, der eine Endkonzentration von 200 g/ml Proteinase K enthält.
      Hinweis: Verwenden Sie für diesen Schritt keinen alten Puffer.
    4. Squish jede Fliege für 10-15 s mit einer Pipette Spitze enthält 50 l Squishing Puffer ohne Abgabe der Flüssigkeit. Geben Sie den verbleibenden Puffer in das Rohr und mischen Sie gut. Bei 37 °C für 20–30 min inkubieren.
    5. Legen Sie die Rohre in einen 95 °C-Wärmeblock für 1–2 min, um die Proteinase K zu inaktivieren.
    6. Spin down für 5 min bei 10.000 x g. Bewahren Sie die Zubereitung bei 4 °C für weitere PCR-Analysen auf.
  4. Verwenden Sie die gleiche Methode, um gDNA aus einer nos-Cas9-Fliege vorzubereiten, die als Negativkontrolle dient. Führen Sie dreistufige PCR-basierte Bildschirme aus, um die korrekten "End-out"-HDR (Abbildung 1, Abbildung 3) zu identifizieren, wobei gDNA jedes F1-Männchens als Vorlage5verwendet wird. Verwenden Sie 1 l der DNA-Vorbereitung in dem folgenden PCR-Reaktionssystem: 10 l 2x PCR Master Mix mit Farbstoff, 1 l jedes Primers (10 'M), 1 l DNA-Vorlage und 7 l ddH2O.
  5. Wie in Abbildung 3Agezeigt, führen Sie PCR mit primer fwd1 und rev1 aus, um das Vorhandensein des Einfügens oder Austauschs zu überprüfen; PCR mit fwd2- und rev2-Primern durchführen, um das Einfügen oder Ersetzen aus 3'-Bereich zu überprüfen; PCR mit Primern M13F und rev3 ausführen, um "Ends-in" HDR zu überprüfen (Tabelle 1C).
  6. Halten Sie die Fliegenlinien mit dem bestätigten End-out HDR und etablieren Sie ausgewogene Bestände aus der F2-Generation. Outcross zum Balancer fliegt wieder, um unbeabsichtigte Mutationen auf anderen Chromosomen zu entfernen.

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Representative Results

Figure 1
Abbildung 1: Eine Übersicht über den Workflow für die CRISPR/Cas9-vermittelte Genombearbeitung, um ein binäres Transkriptionssystem zu generieren. Die ungefähre Zeitdauer, die für jeden Schritt erforderlich ist, wird angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Eine Abbildung des CRISPR-Screenings und des genetischen Cross-Schemas zur Ermittlung genombearbeiteter Fluglinien. In genetischen Kreuzen steht R für das bearbeitete Allel, das sich auf dem3. Chromosom befindet. MKRS (Tp(3;3)MRS, M(3)76A[1] kar[1] ry[2] Sb[1]) ist ein3. Chromosomenmarker; TM6B (In(3LR)TM6B, Antp[Hu] e[1] Tb[1]) ist ein3. Chromosom-Balancer. Genom bearbeitete Fliegenbestände werden durch PCR-Verstärkung der Zielregionen von Interesse aus der genomischen DNA, die entweder aus den F2- oder F3-Generation fliegen extrahiert und Sequenz bestimmen die PCR-Produkte überprüft. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Generierung von bnl-LexA durch CRISPR/Cas9-vermittelten Exonersatz. (A) Schematische Zeichnung, die die Strategie des CRISPR/Cas9 vermittelten HDR für exon-Ersatz im bnl locus darstellt. Box - exon; Line- Intron; Ersatzspender (pDonor-bnl:LexA) und zwei mögliche Ergebnisse der HDR wurden gezeigt. Die pDonor-bnl:LexA hatte folgende Eigenschaften: (1) T2A-nls-LexA:p65 (ca. 1,8 kb) Sequenz, flankiert von 2 kb und 1,8 kb langen Homologiearmen (gestrichelte Linien), (2) ein T2A-Selbstklassigungspeptid zwischen dem verbleibenden N-Terminal bnl exon und dem nls-LexA:p65und (3) einem Translation Stop Codon (rot *) nach der sequenzielle n-LexA:p65. Das HDR-Produkt behielt die gesamte transkriptionelle und posttranskriptionelle Kontrolle von bnlbei, und das LexA:p65-Protein soll im gleichen Muster wie der endogene Bnl produziert werden. Kleine schwarze Pfeile zeigen die relativen Bindungsstellen (nicht im Maßstab) der PCR-Primer (Tabelle 1), die für das 3-stufige Screening oder die RT-PCR-Validierung verwendet werden. (B) Agarose-Gelbilder mit Ergebnissen des 3-stufigen PCR-Screenings. Gezeigt werden PCR-Produkte, die aus der genomischen DNA von vier erfolgreichen End-out-HDR-Linien verstärkt werden; negative Kontrolle, die genomische DNA von nos-Cas9 Elternlinie; positiv zu kontrollieren, pDonor-bnl:LexA Plasmid; M, Marker (SL2K DNA-Leiter). (C) ein Beispiel für das Screening-Gel, das das erwartete PCR-Produkt mit Primern M13F und rev3 für End-In-Linien zeigt; M8-7 und M9-6 sind zwei Endlinien; negative und positive Kontrollen, die gleiche wie in B; M, Marker (NEB 1 kb DNA-Leiter). (D) RT-PCR-Analyse der gesamten RNA aus bnl-LexA und der nos-Cas9-Kontrollfliegen. Forward Primer bindet an eine LexA-spezifische Region, Reverse Primer an eine nachgelagerte bnl exon-Region; Das Amplifikationsband (*) wurde von RT-PCR auf bnl-LexAmRNA nachgewiesen, nicht aber von der Kontroll-RNA. M, 100 bp Marker (NEB). Angepasst an die Figuren 2 und S1 in Du et al. 2017. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

A. gRNA Klonen und Sequenzieren
bnl-lexA gRNA fwd TATATAGGAAAGATATCCGGGTGAACTTCgTGTATCTGCGAT
GCCCCTCATTTAGAGCTAGAAAATAGCAAG
bnl-lexA gRNA rev ATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTCCCGCAATCTGAAGG
ATcGACGTTAAATTGAAAATAGGTC
T3-Primer für die Sequenzierung CAATTA ACCCTCACTAAAAGG-3'
ANMERKUNG: Nukleotide unterstrichen Anneal zu U6-Promotor oder gRNA-Kern auf pCFD4-Vektor, wurde die Kleinbuchstaben g/c zur Unterstützung der U6-Promotor-abhängigen Transkription hinzugefügt
B. HDR-Spenderbau
bnl N-F_pUC19 AATTCGAGCTCGGTACtgtggtctttgaggctggaac
bnl-lexA-N-R tCCGcaagtCagtAGgctgccgcgtccttcgccgga
GCCCGCAGATACAAGGCCCC
lexA-F CTactGacttgCGGaGAtGTcGAaGAGAACCCtGGC
CCtATGCCACCCAAGAAGAAAGC
lexA-R CTAAACGAGTTTTTACAAACTCACTC
bnl lexA-C Fwd TAAAAACTCGTTTAGACGGGATGGCGTTGTCAAC
bnl C-R_pUC19 GCCAAGCTTGCTGCCtcgcataattgccgcctgg
ANMERKUNG: Nukleotide in Kapitalüberlappung mit pUC19 Vektor für Gibson Assembly, Nukleotide unterstrichen waren Sequenzüberhang für T2A Peptid Addition.
C. HDR-Screening und -Sequenzierung
bnl-lexA scr fwd1 GTGGCGCACGCCCAATAAAC
bnl-lexA scr rev1 GATCCCAGCCAATCTCCGTTG
bnl-lexA scr fwd2 CAACGGAGATTGGCTGGGATC
bnl-lexA scr rev2 CTGGCCAACTGTAGGGAAGTC
End-in-Check rev3 GCAATGTTATGCAATGCGTTGAC
bnl-lexA seq fwd3 CACTTGTCGCCCATATTGATACAATTG
HINWEIS: Diese Primer wurden für PCR-Screening und Sequenzierung verwendet, die ungefähren Positionen der Primerbindungsstellen sind in Abbildung 5A als fwd1-2 und rev1-3 dargestellt.
D. RT-PCR-Analyse
RT-f GATATGGATTTCTCCGCTTTGCTG
RT-r CCATGCAGAGATACAGGCAAGTG

Tabelle 1: In dieser Studie verwendete Grundierungen. (A) Primer zum Klonen von gRNA-Expressionsvektor und Sequenzierung. (B) Primer zum Klonen von HDR-Spendervorlagen. (C) Grundierungen zum Screening und zur Sequenzierung der HDR-Produkte. (D) Grundierungen zur RT-PCR-Verifizierung des chimer LexA-bnl mRNA-Produkts.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris-HCl Sigma Aldrich T3253 Molecular Biology
EDTA Sigma Aldrich E1161 Molecular Biology
NaCl Sigma Aldrich S7653 Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water ThermoFisher Scientific 10977-023 Molecular Biology
Primers IDT-DNA PCR
Proteinase K ThermoFisher Scientific 25530049 Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red) Sydlab MB067-EQ2R Molecular Biology
MKRS/TB6B Kornberg lab Fly line
CO2 station Genesee Scientific 59-122WCU fly pushing
Stereo microscope Olympus SZ-61 fly pushing
Microtube homogenizing pestles Fisher-Scientific 03-421-217 genomic DNA isolation

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