Screening per le modifiche genomiche: un metodo per identificare i mutanti generati da CRISPR in Drosophila

Overview

Questo video descrive un metodo di screening per identificare le mosche transgeniche Drosophila, il cui genoma è stato modificato utilizzando CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 è un potente strumento di editing del genoma che ha rivoluzionato il modo in cui gli scienziati possono manipolare il genoma di un organismo. Nel protocollo di esempio, vedremo come identificare i mutanti generati da CRISPR, in cui un inserimento di una sequenza di transattivazione sostituisce il primo esone del gene branchless (bnl), creando così una linea di driver specifica del gene bnl, bnl-LexA.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Du et al., An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing, J. Vis. Exp.

1. Genetica delle voli e screening (figura 1 e figura 2)

1. Quando gli embrioni iniettati si sviluppano in adulti, attraversa ogni singolo G_{0 vola} alle mosche del bilanciatore. Selezionare un bilanciatore adatto per il cromosoma contenente l'allele di destinazione.
2. Anestetizza la prole F1 da ogni croce G0 su un pad di CO₂ e scegli casualmente 10-20 maschi sotto uno stereomicroscopio. Incrociarle singolarmente verso le femmine di bilanciatore, come mostrato nella figura 2.
3. Quando le larve di F2 si schiudono, scegli il singolo padre F1 da ogni croce ed estrai gDNA usando il protocollo di preparazione del DNA genomico a mosca singola:
   1. Preparare tampone di estrazione gDNA: 10 mM Tris-Cl pH 8.2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, conservare a temperatura ambiente. Preparare la soluzione stock di proteinasi K da 20 mg/mL e conservarla nel congelatore.
   2. Mettere ogni mosca in un tubo di micro-centrifuga da 1,5 ml ed etichettare il tubo. Conservare nel congelatore a -80 °C durante la notte.
   3. Preparare un nuovo volume di lavoro del tampone di estrazione della gDNA contenente 200 μg/mL di concentrazione finale di proteinasi K.
      Nota: non utilizzare un vecchio buffer per questo passaggio.
   4. Squish ogni mosca per 10-15 s con una punta di pipetta contenente 50 μL di tampone di schiacciamento senza erogare il liquido. Distribuire il tampone rimanente nel tubo e mescolare bene. Incubare a 37 °C per 20-30 min.
   5. Mettere i tubi in un blocco di calore a 95 °C per 1-2 minuti per inattivare la Proteinasi K.
   6. Spin down per 5 minuti a 10.000 x g. Conservare la preparazione a 4 °C per ulteriori analisi PCR.
4. Usa lo stesso metodo per preparare il gDNA da una mosca nos-Cas9, che funge da controllo negativo. Eseguire schermate basate su PCR in tre istruzioni per identificare l'HDR "end out" corretto (Figura 1, Figura 3) utilizzando gDNA di ogni maschio F1 come modello⁵. Utilizzare 1 μL della preparazione del DNA nel seguente sistema di reazione PCR: 10 μL di 2x PCR Master Mix with Dye, 1 μL di ogni primer (10 μM), 1 μL di modello di DNA e 7 μL di ddH₂O.
5. Come illustrato nella figura 3A, eseguire PCR utilizzando primer fwd1 e rev1 per eseguire lo schermo per l'esistenza dell'inserimento o della sostituzione; eseguire PCR utilizzando primer fwd2 e rev2 per verificare l'inserimento o la sostituzione dall'area 3'; eseguire PCR utilizzando primer M13F e rev3 per controllare HDR "end-in" (Tabella 1C).
6. Mantieni le linee di volo con l'HDR end-out confermato e stabilisci scorte bilanciate della generazione F2. L'outcross al bilanciatore vola di nuovo per rimuovere eventuali mutazioni indesiderate su altri cromosomi.

Representative Results

Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro per l'editing del genoma mediato da CRISPR/Cas9 per generare un sistema di trascrizione binario. Viene indicata la durata approssimativa del tempo richiesta per ogni passaggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Illustrazione dello screening CRISPR e dello schema genetico incrociato per la creazione di linee di volo modificate dal genoma. Nelle croci genetiche, R sta per l'allele modificato che si trova sul cromosoma 3^rd. MKRS (Tp(3;3)MRS, M(3)76A[1] kar[1] ry[2] Sb[1]), è un marcatore cromosomico 3^rd; TM6B (In(3LR)TM6B, Antp[Hu] e[1] Tb[1]) è un^{bilanciatore cromosomico} 3 rd. Le scorte di mosca modificate dal genoma sono verificate dalla PCR amplificando le regioni bersaglio di interesse dal DNA genomico estratto dalle mosche di generazione F2 o F3 e dalla sequenza che determina i prodotti PCR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Generazione di bnl-LexA mediante sostituzione dell'esone mediato da CRISPR/Cas9. (A) Disegno schematico raffigurante la strategia dell'HDR mediato CRISPR/Cas9 per la sostituzione dell'esone nel locus bnl. Scatola - esone; linea-introne; donatore sostitutivo (pDonor-bnl:LexA) e sono stati mostrati due possibili risultati dell'HDR. Il pDonor-bnl:LexA aveva le seguenti caratteristiche: (1) T2A-nls-LexA:p65 (~1,8 kb) di fronte a 2 kb e 1,8 kb di bracci di omologia lunghi (linee tratteggiate), (2) un peptide auto-fendinte T2A tra l'esone residuo N terminale bnl e il nls-LexA:p65e (3) un codone di arresto della traduzione (rosso *) dopo la sequenza nls-LexA:p65. Il prodotto HDR ha mantenuto tutto il controllo trascrizionale e post-trascrizionale di bnle la proteina LexA:p65 dovrebbe essere prodotta nello stesso modello del Bnlendogeno. (B) Immagini in gel di agarosio che mostrano i risultati dello screening PCR in 3 step. Vengono mostrati prodotti PCR amplificati dal DNA genomico di quattro linee HDR end-out di successo; controllo negativo, il DNA genomico della linea genitoriale nos-Cas9; controllo positivo, pDonor-bnl:LexA plasmide; M, Marker (scala del DNA SL2K). (C) Un esempio del gel di screening che mostra il prodotto PCR previsto utilizzando primer M13F e rev3 per linee di end-in; M8-7 e M9-6 sono due linee di estremità; controlli negativi e positivi, gli stessi di cui al punto B; M, Marker (SCALA DNA NEB 1 kb). (D) Analisi RT-PCR sull'RNA totale di bnl-LexA e delle mosche di controllo nos-Cas9. Il primer in avanti si lega a una regione specifica di LexA, il primer inverso si lega a una regione esone bnl a valle; La banda di amplificazione di ~440 bp (coppia di basi) (*) è stata rilevata da RT-PCR sull'mRNA bnl-LexA,ma non dall'RNA di controllo. Marcatore M, 100 bp (NEB). Adattato dalle figure 2 e S1 in Du et al. 2017. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

A. clonazione e sequenziamento del gRNA
bnl-lexA gRNA fwd	TATATAGGAAAGATATCCGGGTGAACTTCgTGTATCTGCGAT
	GCCCCTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
bnl-lexA gRNA rev	ATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTAAACTCCCGCAATATCTGAAGG
	ATcGACGTTAAATTGAAAATAGGTC
Primer T3 utilizzato per il sequenziamento	CAATTA ACCCTCACTAAGG-3'
NOTA: i nucleotidi hanno sottolineato la ricottura al promotore U6 o al nucleo di gRNA sul vettore pCFD4, il g/c minuscolo è stato aggiunto per aiutare la trascrizione dipendente dal promotore U6
B. Costruzione di donatori HDR
N-F_pUC19 bnl	AATTCGAGCTCGGTACtgtggtctttgaggctggaac
bnl-lexA-N-R	tCCGcaagtCagtAGgctgccgcgtccttcgccgga GCCCGCAGATACAAGGCCCC
lexA-F	CTactGacttgCGGaGAtGTcGAaGAGAACCCtGGC CCtATGCCACCCAAGAAGAAGC
lexA-R	CTAAACGAGTTTTTAAGCAAACTCACTC
bnl lexA-C Fwd	TAAAAACTCGTTTAGACGGGATGGCGTTGTCAAC
bnl C-R_pUC19	GCCAAGCTTGCATGCCtcgcataattgccgcctgg
NOTA: i nucleotidi nella capitale si sovrappongono al vettore pUC19 per l'assemblaggio Gibson, i nucleotidi sottolineati erano sovrasogni di sequenza per l'addizione peptidica T2A.
C. Screening e sequenziamento HDR
bnl-lexA scr fwd1	GTGGCGCACGCCCAATAAAC
bnl-lexA scr rev1	GATCCCAGCCAATCTCCGTTG
bnl-lexA scr fwd2	CAACGGAGATTGGCTGGGATC
bnl-lexA scr rev2	CTGGCCAACTGTAGGGAAGTC
check-in fine rev3	GCAATGTTATGCAATGCGTTGAC
bnl-lexA seq fwd3	CACTTGTCGCCCATATTGATACAATTG
NOTA: Questi primer sono stati utilizzati per lo screening e il sequenziamento pcr, le posizioni approssimative dei siti di associazione del primer sono mostrate nella figura 5A come fwd1-2 e rev1-3.
D. Analisi RT-PCR
Rt-f	GATATGGATTTCTCCGCTTTGCTGCTG
Rt-r	CCATGCAGATACAGGCAAGTG

Tabella 1: Primer utilizzati nel presente studio. (A) Primer per la clonazione del vettore di espressione del gRNA e il sequenziamento. (B) Primer per la clonazione del modello di donatore HDR. (C) Primer per lo screening e il sequenziamento dei prodotti HDR. (D) Primer utilizzati per la verifica RT-PCR del prodotto chimerico LexA-bnl mRNA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Molecular Biology
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Molecular Biology
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water	ThermoFisher Scientific	10977-023	Molecular Biology
Primers	IDT-DNA		PCR
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red)	Sydlab	MB067-EQ2R	Molecular Biology
MKRS/TB6B	Kornberg lab		Fly line
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU	fly pushing
Stereo microscope	Olympus	SZ-61	fly pushing
Microtube homogenizing pestles	Fisher-Scientific	03-421-217	genomic DNA isolation