Overview
Denne videoen beskriver en screeningmetode for å identifisere transgene Drosophila-fluer, hvis genom ble modifisert ved hjelp av CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 er et kraftig genomredigeringsverktøy som revolusjonerte måten forskere kan manipulere en organismes genom på. I eksempelprotokollen vil vi se hvordan du identifiserer CRISPR-genererte mutanter, der en innsetting av en transaktiveringssekvens erstatter den første eksonen til det grenløse (bnl) genet, og dermed skaper en bnl genspesifikk driverlinje, bnl-LexA.
Protocol
Denne protokollen er et utdrag fra Du et al.,en effektiv strategi for å generere vevsspesifikke binære transkripsjonssystemer i Drosophila ved genomredigering, J. Vis. Exp. (2018).
1. Flygenetikk og screening (figur 1 og figur 2)
- Når de injiserte embryoene utvikler seg til voksne, kryss hver enkelt G0 flyr til balanserefluer. Velg passende balansere for kromosomet som inneholder den målrettede allelen.
- Bedøv F1-avkomene fra hvert G0-kryss på en CO2-pute og velg tilfeldig 10-20 menn under et stereomikroskop. Kryss dem individuelt til balanserende kvinner som vist i figur 2.
- Når F2 larver klekkes, velg den ene F1-faren fra hvert kors og trekk ut gDNA ved hjelp av single fly genomisk DNA-forberedelsesprotokoll:
- Klargjør gDNA ekstraksjonsbuffer: 10 mM Tris-Cl pH 8,2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, oppbevar ved romtemperatur. Forbered 20 mg/ml Proteinase K lagerløsning og oppbevar den i fryseren.
- Sett hver flue i et 1,5 ml mikrosentrifugerør og merk røret. Oppbevars i fryseren -80 °C over natten.
- Forbered et nytt arbeidsvolum av gDNA ekstraksjonsbuffer som inneholder 200 μg / ml endelig konsentrasjon av Proteinase K.
Merk: Ikke bruk en gammel buffer for dette trinnet. - Klem hver flue i 10-15 s med en pipettespiss som inneholder 50 μL squishing buffer uten å dispensere væsken. Dispenser den gjenværende bufferen i røret og bland godt. Inkuber ved 37 °C i 20–30 min.
- Sett rørene i 95 °C varmeblokk i 1–2 min for å inaktivere Proteinase K.
- Spinn ned i 5 min ved 10.000 x g. Oppbevar preparatet ved 4 °C for ytterligere PCR-analyse.
- Bruk samme metode for å forberede gDNA fra en nos-Cas9 fly, som fungerer som en negativ kontroll. Utfør tretrinns PCR-baserte skjermbilder for å identifisere riktig "ender ut" HDR (Figur 1, Figur 3) ved hjelp av gDNA for hver F1-mann som mal5. Bruk 1 μL av DNA-prep i følgende PCR reaksjonssystem: 10 μL av 2x PCR Master Mix med Dye, 1 μL av hver primer (10 μM), 1 μL DNA-mal og 7 μL ddH2O.
- Som vist i figur 3A, utfør PCR ved hjelp av primere fwd1 og rev1 for å skjerme for eksistensen av innsetting eller utskifting; utføre PCR ved hjelp av fwd2 og rev2 primere for å bekrefte innsetting eller utskifting fra 3 'region; utføre PCR ved hjelp av primere M13F og rev3 for å sjekke "ends-in" HDR (Tabell 1C).
- Hold flylinjene med den bekreftede end-out HDR og etablere balanserte aksjer fra F2-generasjonen. Outcross til balanseren flyr igjen for å fjerne utilsiktede mutasjoner på andre kromosomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1: En oversikt over arbeidsflyt for CRISPR/Cas9-mediert genomredigering for å generere et binært transkripsjonssystem. Den omtrentlige tidsvarigheten som kreves for hvert trinn, er angitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: En illustrasjon av CRISPR-screeningen og genetisk kryssordning for etablering av genomredigerte flylinjer. I genetiske kryss står R for den redigerte allelen som er på 3 rd-kromosomet. MKRS (Tp(3;3)MRS, M(3)76A[1] kar[1] ry[2] Sb[1]), er en 3rd kromosommarkør; TM6B (In(3LR)TM6B, Antp[Hu] e[1] Tb[1]) er en 3rd kromosombalanser. Genom redigerte fluebestander verifiseres av PCR som forsterker målområdene av interesse fra det genomiske DNA hentet fra enten F2- eller F3-generasjonen fluer og sekvens som bestemmer PCR-produktene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Generasjon bnl-LexA ved CRISPR/Cas9-mediert exon-erstatning. (A) Skjematisk tegning som viser strategien til CRISPR/Cas9 mediert HDR for eksonerstatning i bnl locus. Boks - exon; linje-intron; erstatningsdonor (pDonor-bnl:LexA) og to mulige utfall av HDR ble vist. pDonor-bnl:LexA hadde følgende funksjoner: (1) T2A-nls-LexA:p65 (~1.8kb) sekvens flankert av 2 kb og 1.8 kb lange homologi armer (stiplede linjer), (2) et T2A selvklebende peptid mellom den gjenværende N-terminalen bnl exon og nls-LexA:p65, og (3) en oversettelsesstopp codon (rød *) etter nls-LexA:p65-sekvensen. HDR-produktet beholdt all transkripsjonell og posttranskripsjonell kontroll av bnl, og LexA:p65-proteinet forventes å bli produsert i samme mønster som endogene Bnl. Små svarte piler viser de relative bindingsstedene (ikke i skala) av PCR-primerne (tabell 1) som brukes til 3-trinns screening eller RT-PCR-validering. (B) Agarose gel bilder som viser resultater av 3-trinns PCR screening. PCR-produkter forsterket fra det genomiske DNA-et til fire vellykkede hdr-linjer er vist; negativ kontroll, det genomiske DNA-et til nos-Cas9 foreldrelinje; positiv kontroll, pDonor-bnl:LexA plasmid; M, Markør (SL2K DNA-stige). (C) Et eksempel på screeninggelen som viser det forventede PCR-produktet ved hjelp av primere M13F og rev3 for ender i linjer; M8-7 og M9-6 er to ender i linjer; negative og positive kontroller, det samme som i B; M, Markør (NEB 1 kb DNA-stige). (D) RT-PCR-analyse på total RNA fra bnl-LexA og nos-Cas9-kontrollen flyr. Fremoverprimer binder seg til en LexA-spesifikk region, omvendt primer binder seg til en nedstrøms bnl exon-region; ~440 bp (base-pair) forsterkningsbånd (*) ble oppdaget fra RT-PCR på bnl-LexAmRNA, men ikke fra kontrollen RNA. M, 100 bp markør (NEB). Tilpasset fra figur 2 og S1 i Du et al. 2017. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| A. gRNA kloning og sekvensering | |
| bnl-lexA gRNA fwd | TATATAGGAAAGATATCCGGGTGAACTTCgTGTATCTGCGAT |
| GCCCCTCAGTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG | |
| bnl-lexA gRNA rev | ATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTCCCGCAATATCTGAAGG |
| ATcGACGTTAAATTGAAAATAGGTC | |
| T3 primer brukes til sekvensering | CAATTA ACCCTCACTAAAGG-3' |
| MERK: Nukleotider understreket anneal til U6 promotør eller gRNA kjerne på pCFD4 vektor, små g / c ble lagt til for å hjelpe U6 promotoravhengig transkripsjon | |
| B. HDR donor konstruksjon | |
| bnl N-F_pUC19 | AATTCGAGCTCGGTACtgtggtctttgaggctggaac |
| bnl-lexA-N-R | tCCGcaagtCagtAGgctgccgcgtccttcgccgga GCCCGCAGATACAAGGCCCC |
| lexA-F | CTactGacttgCGGaGAtGTcGAaGAGAACCCtGGC CCtATGCCACCCAAGAAGAAGC |
| lexA-R | CTAAACGAGTTTTTAAGCAAACTCACTC |
| bnl lexA-C Fwd | TAAAAACTCGTTTAGACGGGATGGCGTTGTCAAC |
| bnl C-R_pUC19 | GCCAAGCTTGCATGCCtcgcataattgccgcctgg |
| MERK: Nukleotider i stor overlapping med pUC19 vektor for Gibson Assembly, nukleotider understreket var sekvensoverheng for T2A peptid tillegg. | |
| C. HDR-screening og sekvensering | |
| bnl-lexA scr fwd1 | GTGGCGCACGCCCAATAAAC |
| bnl-lexA scr rev1 | GATCCCAGCCAATCTCCGTTG |
| bnl-lexA scr fwd2 | CAACGGAGATTGGCTGGGATC |
| bnl-lexA scr rev2 | CTGGCCAACTGTAGGGAAGTC |
| ender-in sjekk rev3 | GCAATGTTATGCAATGCGTTGAC |
| bnl-lexA seq fwd3 | CACTTGTCGCCCATATTGATACAATTG |
| MERK: Disse primerne ble brukt til PCR-screening og sekvensering, de omtrentlige plasseringene til primerbindingssteder er vist i figur 5A som fwd1-2 og rev1-3. | |
| D. RT-PCR-analyse | |
| RT-f | GATATGGATTTCTCCGCTTTGCTG |
| RT-r | CCATGCAGAGATACAGGCAAGTG |
Tabell 1: Primere brukt i denne studien. (A) Primere for kloning av gRNA-uttrykksvektor og sekvensering. (B) Primere for kloning av HDR-donormal. (C) Primere for screening og sekvensering av HDR-produktene. (D) Primere som brukes til RT-PCR-verifisering av det chimeriske LexA-bnl mRNA-produktet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | Molecular Biology |
| EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | Molecular Biology |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Molecular Biology |
| UltraPure DNase/RNase-Free Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | Molecular Biology |
| Primers | IDT-DNA | PCR | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | Molecular Biology |
| 2x PCR PreMix, with dye (red) | Sydlab | MB067-EQ2R | Molecular Biology |
| MKRS/TB6B | Kornberg lab | Fly line | |
| CO2 station | Genesee Scientific | 59-122WCU | fly pushing |
| Stereo microscope | Olympus | SZ-61 | fly pushing |
| Microtube homogenizing pestles | Fisher-Scientific | 03-421-217 | genomic DNA isolation |
