Скрининг на геномные модификации: метод идентификации мутантов, генерируемых CRISPR в Дрозофиле

Overview

Это видео описывает метод скрининга для выявления трансгенных мух дрозофилы, чей геном был изменен с помощью CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 является мощным инструментом редактирования генома, который произвел революцию в том, как ученые могут манипулировать геномом организма. В примере протокола мы увидим, как идентифицировать мутантов, генерируемых CRISPR, в которых вставка последовательности трансактивации заменяет первый экзон неотвеченного (bnl)гена, создавая тем самым генную линию драйвера bnl-LexA.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Du et al., Эффективной стратегии для генерации тканей конкретных бинарных транскрипционных систем в Drosophila по редактированию генома, J. Vis. Exp. (2018).

1. Fly генетики и скрининга (рисунок 1 и рисунок 2)

1. Когда инъекционные эмбрионы развиваются во взрослых, пересекайте каждую G₀ мух к балансер мух. Выберите подходящий балансер для хромосомы, содержащей целевой аллель.
2. Обезболивать потомство F1 от каждого креста G0 на площадке CO₂ и случайным образом выбрать 10-20 мужчин под стереомикроскопом. Пересеките их по отдельности к женщинам-балансерам, как показано на рисунке 2.
3. Когда личинки F2 вылупятся, выберите одного отца F1 из каждого креста и извлекайте gDNA с помощью протокола подготовки одной мухи геномной ДНК:
   1. Подготовь буфер извлечения гДНА: 10 мМ Трис-Кл рН 8,2, 1 мМ ЭДТА, 25 мМ. NaCl, хранить при комнатной температуре. Приготовьте 20 мг/мл раствора Proteinase K и храните в морозильной камере.
   2. Поместите каждую муху в трубку микро-центрифуги 1,5 мл и обозначите трубку. Хранить в морозильной камере -80 градусов по Цельсию на ночь.
   3. Подготовь новый рабочий объем буфера извлечения гДНК, содержащего 200 мкг/мл окончательной концентрации протеиназы К.
      Примечание: Не используйте старый буфер для этого шага.
   4. Squish каждая муха в течение 10-15 с кончиком пипетки, содержащей 50 йл хлюпать буфер без дозирования жидкости. Выпределите оставшийся буфер в трубку и хорошо перемешайте. Инкубация при 37 градусов по Цельсию в течение 20-30 мин.
   5. Положите трубки в тепловой блок 95 градусов по Цельсию в течение 1-2 мин для инактивации протеиназы К.
   6. Спин вниз в течение 5 мин на 10000 х г. Храните препарат на уровне 4 градусов по Цельсию для дальнейшего анализа ПЦР.
4. Используйте тот же метод для подготовки gDNA от nos-Cas9 летать, который служит в качестве отрицательного контроля. Выполните трехшаговой ПЦР на основе экранов, чтобы определить правильный "концы" HDR (Рисунок 1, Рисунок 3) с помощью gDNA каждого мужчины F1 в качестве^{шаблона 5}. Используйте 1 МКЛ подготовки ДНК в следующей системе реакции ПЦР: 10 йл 2x PCR Master Mix с красителем, 1 йл каждой грунтовке (10 МКМ), 1 йл шаблона ДНК и 7 МКЛ ddH₂O.
5. Как показано на рисунке 3A, выполнить ПЦР с помощью грунтовки fwd1 и rev1 для экрана для существования вставки или замены; выполнить ПЦР с использованием fwd2 и rev2 грунтовки для проверки вставки или замены из 3' региона; выполнять ПЦР с помощью грунтовок M13F и rev3 для проверки HDR "ends-in"(таблица 1C).
6. Держите лету линий с подтвержденными концами из HDR и установить сбалансированные запасы от F2 поколения. Перейти к балансер летит снова, чтобы удалить любые непреднамеренные мутации на других хромосомах.

Representative Results

Рисунок 1: Обзор рабочего процесса для редактирования генома при посредничестве CRISPR/Cas9 для создания двоичной системы транскрипции. Указана примерная продолжительность времени, необходимая для каждого шага. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Иллюстрация скрининга CRISPR и генетической схемы перекрестного установления линий мух, редактируемых геномом. В генетических крестах R означает отредактированный аллель, который находится на 3-й^{хромосоме.} MKRS (Tp(3;3)MRS, M(3)76A '1' kar'1 ' sb'1)- это 3-й^{хромосомный} маркер; ТМ6Б (In(3LR)TM6B, Antp-Hu'e'1) — 3-й^{хромосомный} балансер. Геном отредактированные запасы мух проверяются ПЦР, усиливая целевые области, представляющие интерес из геномной ДНК, извлеченной из мух поколения F2 или F3, и последовательности, определяющей продукты ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Поколение bnl-LexA по CRISPR/Cas9-опосредованная замена экзона. (A) Схематический рисунок, изображающий стратегию CRISPR/Cas9 опосредованного HDR для замены exon в локусе bnl. Коробка - экзон; линия-интрон; замена донора (pDonor-bnl:LexA) и два возможных исхода HDR были показаны. PDonor-bnl:LexA имел следующие особенности: (1) T2A-nls-LexA:p65 (No1.8kb) последовательность в окружении 2 кб и 1,8 кб длинные гомологии оружия (dashed линий ), (2) T2A саморазрядный пептид между остаточным N терминалом bnl exon и nls-LexA:p65, и (3) перевод стоп-кодон (красный) после nls-LexA:p65 последовательности. Продукт HDR сохранил все транскрипционные и пост-транскрипционные контроля bnl, и LexA:p65 белка, как ожидается, будет производиться в той же схеме, как эндогенные Bnl. Малые черные стрелки показывают относительные связывающие сайты (не в масштабе) из ПЦРгрунтовки( Таблица 1 ) используется для 3-шаг скрининга или RT-PCR проверки. (B) Агароза гель фотографии, показывающие результаты 3-шаг ПЦР скрининга. Показаны продукты ПЦР, усиленные из геномной ДНК четырех успешных линий HDR; отрицательный контроль, геномная ДНК nos-Cas9 родительской линии; положительный контроль, pDonor-bnl:LexA плазмид; M, Маркер (лестница ДНК SL2K). c) пример скринингового геля, показывающего ожидаемый продукт ПЦР с использованием грунтовок M13F и rev3 для линий конца; M8-7 и M9-6 являются двумя линиями конца; отрицательный и положительный контроль, такой же, как и в B; M, Маркер (NEB 1 кб ДНК лестницы). (D) анализ RT-PCR по общей РНК от bnl-LexA и nos-Cas9 управления мух. Вперед грунтовка связывается с LexA конкретного региона, обратный грунт связывается с ниже по течению bnl Exon региона; Полоса усиления (базовая пара) была обнаружена у RT-PCR на bnl-LexAmRNA, но не от контрольной РНК. M, 100 bp Маркер (NEB). Адаптировано из рисунков 2 и S1 в Du et al. 2017. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.

A. клонирование и секвенирование РНК
bnl-lexA gRNA fwd	ТАТАТАГААГАТАТККГТГААКТТКТГТТТХТГКГАТ
	ССЗККТКТТТЛТТАГАГКТАГААТАГКААГ
bnl-lexA gRNA rev	АТТТТААКТТХТАКТТТТТАГТКТКТАААКТККГКХААТАТКТГААГГ
	ATcGACGTTAAATTGAAAATAGGTC
T3 грунтовка, используемая для секвенирования	КААТТА ACCCTCACTAAAGG-3'
ПРИМЕЧАНИЕ: нуклеотиды подчеркнули анналь для U6 промоутер или ядро gRNA на векторе pCFD4, нижний регистр g/c был добавлен, чтобы помочь U6 промоутер-зависимой транскрипции
B. Строительство доноров HDR
bnl N-F_pUC19	AATTCGAGCTCGGTACtggttttgaggctggaac
bnl-lexA-N-R	tCCGcaagtCagtAGgctgccgcgtccttcgccgga ГКГКХАКАКААГКК
lexA-F	CTactGacttgCGGaGAtGTcGAaGAGAACCCtGGC CCtATGCCACCCAAGAAGAAGC
lexA-R	CTAAACGAGTTTTTAAGCAACTCACTCC
bnl lexA-C Fwd	ТАААААКТКГТТАГАГГАГГГГТТГТАК
bnl C-R_pUC19	GCCAAGCTTGCATCtcgcataattgccgcctgg
ПРИМЕЧАНИЕ: нуклеотиды в капитале перекрываются вектором pUC19 для Гибсон Ассамблеи, нуклеотиды подчеркнули были последовательность свес для T2A пептида того.
C. HDR скрининг и секвенирование
bnl-lexA scr fwd1	GTGGCGCACGCCCAATAAAC
bnl-lexA scr rev1	ГАТККАГККААТКТКТТТГ
bnl-lexA scr fwd2	CAACGGAGATTGGCTGGGATC
bnl-lexA scr rev2	CTGGCCAACTGTAGGAAGTC
окончание проверки rev3	GCAATGTTATGCAATGCGTTGAC
bnl-lexA seq fwd3	CACTTGTCGCCCATATTGATACAATTG
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти грунтовки были использованы для скрининга и секвенирования ПЦР, приблизительное расположение грунтовки связывающих сайтов показано на рисунке 5A как fwd1-2 и rev1-3.
D. Анализ RT-PCR
РТ-Ф	ГАГАТГГАТТКТКГКТТТГКТТГ
РТ-р	CCATGCAGAGATACAGGCAAGTG

Таблица 1: Праймеры, используемые в данном исследовании. (A)Праймеры для клонирования вектора экспрессии гРНК и секвенирования. (B)Праймеры для клонирования шаблона донора HDR. (C)Праймеры для скрининга и секвенирования продуктов HDR. (D)Праймеры, используемые для проверки RT-PCR химерного продукта LexA-bnl mRNA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Molecular Biology
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Molecular Biology
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water	ThermoFisher Scientific	10977-023	Molecular Biology
Primers	IDT-DNA		PCR
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red)	Sydlab	MB067-EQ2R	Molecular Biology
MKRS/TB6B	Kornberg lab		Fly line
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU	fly pushing
Stereo microscope	Olympus	SZ-61	fly pushing
Microtube homogenizing pestles	Fisher-Scientific	03-421-217	genomic DNA isolation