Detección de modificaciones genómicas: un método para identificar mutantes generados por CRISPR en Drosophila

Overview

Este video describe un método de cribado para identificar moscas Drosophila transgénicas, cuyo genoma fue modificado usando CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 es una poderosa herramienta de edición del genoma que revolucionó la forma en que los científicos pueden manipular el genoma de un organismo. En el protocolo de ejemplo, veremos cómo identificar mutantes generados por CRISPR, en los que una inserción de una secuencia de transactivación reemplaza al primer exón del gen sin ramas (bnl),creando así una línea conductora específica del gen bnl, bnl-LexA.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Du et al., An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing, J. Vis. Exp. (2018).

1. Genética de mosca y cribado (Figura 1 y Figura 2)

1. Cuando los embriones inyectados se convierten en adultos, cruza cada una de las moscas G₀ a las moscas balanceadoras. Seleccione el equilibrador adecuado para el cromosoma que contiene el alelo objetivo.
2. Anestesia a la descendencia F1 de cada cruz G0 en una almohadilla de CO₂ y elige aleatoriamente 10-20 machos bajo un estereomicroscopio. Crucen individualmente a las hembras balanceadoras como se muestra en la Figura 2.
3. Cuando las larvas F2 eclosionen, elija el padre F1 único de cada cruz y extraiga gDNA usando el protocolo de preparación de ADN genómico de una sola mosca:
   1. Preparar el búfer de extracción gDNA: 10 mM Tris-Cl pH 8.2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, almacenar a temperatura ambiente. Preparar 20 mg/mL Proteinase K solución de stock y almacenar en el congelador.
   2. Ponga cada mosca en un tubo de micro centrífuga de 1,5 ml y etiquete el tubo. Conservar en el congelador -80 °C durante la noche.
   3. Prepare un nuevo volumen de trabajo del tampón de extracción de gDNA que contenga una concentración final de 200 μg/ml de Proteinase K.
      Nota: No utilice un búfer antiguo para este paso.
   4. Aplastar cada mosca durante 10-15 s con una punta de pipeta que contiene 50 μL de amortiguador de calamar sin dispensar el líquido. Dispense el búfer restante en el tubo y mezcle bien. Incubar a 37 °C durante 20-30 min.
   5. Coloque los tubos en un bloque de calor de 95 °C durante 1-2 minutos para inactivar la Proteinase K.
   6. Baja durante 5 min a 10.000 x g. Guarde la preparación a 4 °C para un análisis posterior de PCR.
4. Utilice el mismo método para preparar gDNA de una mosca nos-Cas9, que sirve como control negativo. Realice pantallas basadas en PCR de tres pasos para identificar el HDR "ends out" correcto (Figura 1, Figura 3) utilizando gDNA de cada macho F1 como plantilla⁵. Utilice 1 μL de la preparación del ADN en el siguiente sistema de reacción PCR: 10 μL de 2x PCR Master Mix with Dye, 1 μL de cada imprimación (10 μM), 1 μL de plantilla de ADN y 7 μL de ddH₂O.
5. Como se muestra en la Figura 3A, realice PCR utilizando imprimaciones fwd1 y rev1 para detectar la existencia de la inserción o sustitución; realizar PCR utilizando imprimaciones fwd2 y rev2 para verificar la inserción o sustitución de la región de 3'; realizar PCR utilizando imprimaciones M13F y rev3 para comprobar hdr "end-in" (Tabla 1C).
6. Mantenga las líneas de vuelo con el HDR final confirmado y establezca acciones equilibradas a partir de la generación F2. Outcross al equilibrador vuela de nuevo para eliminar cualquier mutación involuntaria en otros cromosomas.

Representative Results

Figura 1: Una visión general del flujo de trabajo para la edición del genoma mediada por CRISPR/Cas9 para generar un sistema de transcripción binaria. Se indica la duración aproximada de tiempo necesaria para cada paso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ilustración del esquema de cribado CRISPR y cruz genética para establecer líneas de vuelo editadas por el genoma. En las cruces genéticas, R significa el alelo editado que está en el cromosoma de 3^rd. MKRS (Tp(3;3)MRS, M(3)76A[1] kar[1] ry[2] Sb[1]), es un marcador cromosómico de 3^rd; TM6B (In(3LR)TM6B, Antp[Hu] e[1] Tb[1]) es un equilibrador cromosómico de 3^rd. Las existencias de moscas editadas por el genoma se verifican amplificando las regiones objetivo de interés del ADN genómico extraído de las moscas de la generación F2 o F3 y la secuencia que determina los productos PCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Generación de bnl-LexA por reemplazo de exon mediado por CRISPR/Cas9. (A) Dibujo esquemático que representa la estrategia del HDR mediado CRISPR/Cas9 para el reemplazo exon en el locus bnl. Caja - exon; línea- intron; se mostraron donantes de reemplazo (pDonor-bnl:LexA)y dos posibles resultados del HDR. El pDonor-bnl:LexA tenía las siguientes características: (1) T2A-nls-LexA:p65 (~1.8kb) secuencia flanqueada por brazos de homología de 2 kb y 1,8 kb de largo (líneas discontinuas), (2) un péptido auto-cleaving T2A entre el residuo N terminal bnl exon y el nls-LexA:p65, y (3) un codo de parada de traducción (rojo *) después de la secuencia nls-LexA:p65. El producto HDR conservaba todo el control transcripcional y post-transcripcional de bnl,y se espera que la proteína LexA:p65 se produzca en el mismo patrón que las flechas negras endógenas Bnl. Pequeñas flechas negras muestran los sitios de unión relativos (no en escala) de las imprimaciones PCR(Tabla 1)utilizadas para la detección en 3 pasos o la validación RT-PCR. (B) Imágenes de gel de Agarose que muestran los resultados de la detección de PCR de 3 pasos. Se muestran los productos de PCR amplificados a partir del ADN genómico de cuatro líneas HDR finales exitosas; control negativo, el ADN genómico de la línea parental nos-Cas9; control positivo, pDonor-bnl:Plásmido LexA; M, Marker (escalera de ADN SL2K). (C) Un ejemplo del gel de cribado que muestra el producto PCR esperado utilizando imprimaciones M13F y rev3 para líneas de fin; M8-7 y M9-6 son dos líneas finales; controles negativos y positivos, los mismos que en B; M, Marcador (escala de ADN NEB de 1 kb). (D) Análisis RT-PCR sobre el ARN total de bnl-LexA y las moscas de control nos-Cas9. La imprimación delantera se une a una región específica de LexA, la imprimación inversa se une a una región bnl exon aguas abajo; ~440 bp (par base) banda de amplificación (*) se detectó de RT-PCR en el ARNm bnl-LexA,pero no del ARN de control. M, Marcador de 100 bp (NEB). Adaptado de las Figuras 2 y S1 en Du et al. 2017. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

A. clonación y secuenciación de GRNA
bnl-lexA gRNA fwd	TATATAGGAAAGATATCCGGGTGAACTTCGTGTATCTGCGAT
	GCCCCTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
bnl-lexA gRNA rev	ATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTCTAAACTCCCGCAATATCTGAAGG
	ATcGACGTTAAATTGAAAATAGGTC
Imprimación T3 utilizada para la secuenciación	CAATTA ACCCTCACTAAAGG-3'
NOTA: nucleótidos subrayados recocidos a promotor U6 o núcleo de gRNA en vector pCFD4, el g/c minúscula se añadió para ayudar a la transcripción dependiente del promotor U6
B. Construcción de donantes hdr
bnl N-F_pUC19	AATTCGAGCTCGGTACtgtggtctttgaggctggaac
bnl-lexA-N-R	tCCGcaagtCagtAGgctgccgcgtctcgccgga GCCCGCAGATACAAGGCCCCCC
lexA-F	CTactGacttgCGGaGAtGTcGAaGAGAACCCtGGC CCtATGCCACCCAAGAAGAAGC
lexA-R	CTAAACGAGTTTTTAAGCAAACTCACTCACTC
bnl lexA-C Fwd	TAAAAACTCGTTTAGACGGGATGGCGTTGTCAAC
bnl C-R_pUC19	GCCAAGCTTGCATGCCtcgcataattgccgcctgg
NOTA: nucleótidos en superposición de capital con vector pUC19 para Gibson Assembly, nucleótidos subrayados fueron voladizo de secuencia para la adición de péptidos T2A.
C. Detección y secuenciación de HDR
bnl-lexA scr fwd1	GTGGCGCACGCCCAATAAAC
bnl-lexA scr rev1	GATCCCAGCCAATCTCCGTTG
bnl-lexA scr fwd2	CAACGGAGATTGGCTGGGATC
bnl-lexA scr rev2	CTGGCCAACTGTAGGGAAGTC
fin de la comprobación rev3	GCAATGTTATGCAATGCGTTGAC
bnl-lexA seq fwd3	CACTTGTCGCCCATATTGATACAATTG
NOTA: Estas imprimaciones se utilizaron para la detección y secuenciación de PCR, las ubicaciones aproximadas de los sitios de encuadernación de imprimación se muestran en la Figura 5A como fwd1-2 y rev1-3.
D. Análisis RT-PCR
RT-f	GATATGGATTTCTCCGCTTTGCTGG
RT-r	CCATGCAGAGATACAGGCAAGTG

Tabla 1: Imprimaciones utilizadas en este estudio. (A) Imprimaciones para clonar vector y secuenciación de expresiones de GRNA. (B) Imprimaciones para clonar la plantilla de donante HDR. (C) Imprimaciones para la detección y secuenciación de los productos HDR. (D) Imprimaciones utilizadas para la verificación RT-PCR del producto quimérico LexA-bnl mRNA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Molecular Biology
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Molecular Biology
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water	ThermoFisher Scientific	10977-023	Molecular Biology
Primers	IDT-DNA		PCR
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red)	Sydlab	MB067-EQ2R	Molecular Biology
MKRS/TB6B	Kornberg lab		Fly line
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU	fly pushing
Stereo microscope	Olympus	SZ-61	fly pushing
Microtube homogenizing pestles	Fisher-Scientific	03-421-217	genomic DNA isolation